Name: whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי R21MH082360 (BGC) וR01HD056315 (NRM), כמו גם באוניברסיטת ג&#39;ורג&#39;יה.

1. דור Riboprobe באמצעות שעתוק במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מוצרי PCR לתבניות שעתוק במבחנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים תכנון PCR עם רצפי פרומוטר שעתוק phage בקצות 5 &#39;שלהם. הערה: רצף האמר...

<ol>
	<li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues:+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization.">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li><li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA.">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li><li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development.">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li><li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo.">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pax[zf-a]:+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube.">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis/TWis+mutant+embryos.">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li><li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li><li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds.">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li><li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo:+gene+expression+in+three+dimensions.">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li><li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis,+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos.">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li><li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal.">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li></ol>

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה הותאמו ממספר מקורות שונים והמותאמים לכל הר עוברי עכברי E8.5-E11.5 יום ישנים. שיטות לכל הר כלאה באתר של עוברי החולייתנים הופיעו לראשונה בשנת 1990 2,5-12 מוקדם. פרוטוקול זה הותאם בעיקר משיטות שפותחו לעוברי Xenopus 7,8, כמו גם עכבר 2,11.</s...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> סוג </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגים </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Digoxigenin-11-uridine-5&#39;-טריפוספט </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> סט טריפוספט Ribonucleoside </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> עמודות ספין מהירות לטיהור רנ&quot;א radiolabeled </td><td> אספקה </td><td> רוש </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> פולימראז T7-RNA </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA פולימראז </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> RNA פולימראז T3 </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 μCi </td><td> מגיב </td><td> פרקין אלמר </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNase אני רקומביננטי, RNase-חופשי </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> דשן, גבישים חסרי צבע ללבן או אבקת גבישית </td><td> מגיב </td><td> דיג </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ טעינת ג&#39;ל </td><td> מגיב </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> אספקה </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker UV 2400 </td><td> ציוד </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diethyl pyrocarbonate </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> D5758-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> נתרן הפארין </td><tד&gt; מגיב </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> מי חמצן 30% במים </td><td> מגיב </td><td> פישר מדעי </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gluteraldehyde, 8% EM כיתה </td><td> מגיב </td><td> Polysciences </td><td> 0/710 </td><td> השתמש בזהירות בהתאם להוראותיו של הייצור </td></tr><tr><td> חסימת מגיב </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 11096176001 </td><td> הפוך למניות 5% וחנות ב -20 ° C </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 10109142001 </td><td> הפוך ל10 מ&quot;ג / מיליליטר המניות ולאחסן ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> RNase T1 </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure פוראמיד </td><td> מגיב </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> hydrochloride Levamisole </td><td> מגיב </td><td> Biomedicals ICN. Inc </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה ריבונוקלאית משמרי torula, סוג שישי </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> R6625 </td><td> פנול / כלורופורם חולץ מספר פעמים וזרז, resuspended בDEPC-dH2O ומאוחסן ב -20 ° C </td></tr><tr><td> ברים נגד Digoxigenin-AP Fab </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> תשתית BM סגול AP, משקעים. מוכן לשימוש פתרון. </td><td> מגיב </td><td> רוש </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> ,,, קיט 4mL ברור סגור למעלה אחסון יאל נוחות </td><td> אספקה </td><td> מדעי הלאומי </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Shake תנור הכלאה אופה N </td><td> ציוד </td><td> Boekel מדעי </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> ביופסיה בטח-Tek </td><td> אספקה </td><td> Fisherbrand </td><td> 15-200-402C </td><td></td></tr><tr><td> בינוני הטבעת רקמת פלוס Paraplast </td><td> מגיב </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> תבניות פיל-A-Way פלסטיק חד פעמיות רקמות הטבעה </td><td> אספקה </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> שקופיות מיקרוסקופ Plus Colorfrost </td><td> אספקה </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> אדום מהיר גרעיני </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> מגיב </td><td> ריצ&#39;רד אלן, מדעי </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos

ההר כולו בהכלאה באתר הוא גישה מאוד אינפורמטיבי להגדרת דפוסי ביטוי גנטי בעוברים. בנהלי כלאה באתר הם ארוכים ותובעני מבחינה טכנית עם צעדים חשובים רבים שביחד תורמים לאיכות התוצאה הסופית. פרוטוקול זה מתאר בפירוט כמה צעדים מרכזי בקרת איכות לייעול תיוג חללית וביצועים. באופן כללי, הפרוטוקול שלנו מספק תיאור מפורט של הצעדים הדרושים לקריטיים reproducibly להשיג תוצאות באיכות גבוהה. ראשית, אנו מתארים את הדור של digoxygenin (DIG) בדיקות שכותרתו RNA באמצעות שעתוק במבחנה של תבניות שנוצרו על ידי PCR DNA. אנחנו מתארים שלושה מבחני בקרת איכות קריטיות לקביעת הסכום, היושרה והפעילות ספציפית של בדיקות DIG-הכותרת. פעולות אלה הן חשובות ליצירת חללית של מספיק רגיש כדי לזהות mRNAs אנדוגניים בעבר עכבר כולו.בנוסף, אנו מתארים שיטות לקיבוע והאחסון של עוברי עכברי E8.5-E11.5 יום ישנים לכלאה באתר. לאחר מכן, אנו מתארים שיטות מפורטות לעיכול K proteinase המוגבל של עוברי rehydrated אחרי את פירוט תנאי ההכלאה, התחליבים לאחר ההכלאה וטיפול RNase להסיר הכלאת בדיקה אינה ספציפית. נוגדן AP מצומדות משמש כדי להמחיש את החללית שהכותרת ולחשוף דפוס הביטוי של תמליל אנדוגני. נציג תוצאות מוצגות מניסויים מוצלחים וניסויים לא טובים טיפוסיים.

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos at JoVE.com

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

כל זה הר<em&gt; באתר</em&gt; פרוטוקול ההכלאה דן שלבים קריטיים המבטיחים תוצאות באיכות גבוהה לשעתק לביטוי במחקרי גן בעוברי עכברי E8.5-E11.5 יום ישנים.

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

תפוקה גבוהה באתרו הכלאה שיטה לאפיון דפוסי ביטוי mRNA של העכבר עוברית בדרכי השתן ואברי המין התחתון

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...