Name: whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00
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यह काम NIH अनुदान R21MH082360 (BGC) और R01HD056315 (एनआरएम) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जॉर्जिया के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया.

1. इन विट्रो प्रतिलेखन में के माध्यम Riboprobe पीढ़ी <ol><li> विट्रो प्रतिलेखन टेम्पलेट्स में पीसीआर उत्पादों की तैयारी. <ol><li> डिजाइनिंग फेज प्रतिलेखन प्रमोटर दृश्यों के साथ अपने 5 &#39;के सिरों म?...

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	<li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues:+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization.">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li><li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA.">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li><li>Maddox, D. M., Condie, B. 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A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo.">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pax[zf-a]:+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube.">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis/TWis+mutant+embryos.">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li><li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li><li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds.">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li><li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo:+gene+expression+in+three+dimensions.">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li><li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis,+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos.">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li><li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal.">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों के विभिन्न स्रोतों के एक नंबर से अनुकूलित किया गया है और पूरे माउंट E8.5 E11.5 दिन पुराने माउस भ्रूण के लिए अनुकूलित. हड्डीवाला भ्रूण की स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट...

<table border="1"><tbody><tr><th> नाम </th><th> टाइप </th><th> कंपनी </th><th> सूचीपत्र संख्या </th><th> टिप्पणियां </th></tr><tr><td> -5&#39;Digoxigenin-11-uridine-triphosphate </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleoside Triphosphate सेट </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Radiolabeled शाही सेना के शुद्धिकरण के लिए त्वरित स्पिन स्तंभ </td><td> आपूर्ति </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 आरएनए पोलीमरेज़ </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 आरएनए पोलीमरेज़ </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 आरएनए पोलीमरेज़ </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α] 32P - 800Ci/mmol 10mCi/ml, μCi 250 </td><td> अभिकर्मक </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> मैं पुनः संयोजक DNase, RNase मुक्त </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> यूरिया, बेरंग करने के लिए सफेद क्रिस्टल या क्रिस्टलीय पाउडर </td><td> अभिकर्मक </td><td> मछुआ </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> जेल loading बफर </td><td> अभिकर्मक </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N + Amersham, </td><td> आपूर्ति </td><td> जीई हेल्थकेयर </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> यूवी 2400 Stratalinker </td><td> उपकरण </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diethyl pyrocarbonate </td><td> अभिकर्मक </td><td> सिग्मा </td><td> D5758-100ml </td><td></td></tr><tr><td> हेपरिन सोडियम </td><td&gt; अभिकर्मक </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> पानी में हाइड्रोजन पेरोक्साइड 30% </td><td> अभिकर्मक </td><td> फिशर वैज्ञानिक </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gluteraldehyde, 8% EM ग्रेड </td><td> अभिकर्मक </td><td> Polysciences </td><td> 0/710 </td><td> निर्माण निर्देश के अनुसार सावधानी से प्रयोग करें </td></tr><tr><td> अभिकर्मक अवरुद्ध </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> -20 डिग्री सेल्सियस पर 5% शेयर और दुकान में बनाओ </td></tr><tr><td> Proteinase कश्मीर </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> Rnase से एक </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> बनाओ के रूप में 10 मिलीग्राम / एमएल और -20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर की दुकान </td></tr><tr><td> Rnase T1 </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> उलFormamide trapure </td><td> अभिकर्मक </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Levamisole हाइड्रोक्लोराइड </td><td> अभिकर्मक </td><td> ICN Biomedicals. इंक </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> Torula खमीर, प्रकार छठी से Ribonucleic एसिड </td><td> अभिकर्मक </td><td> सिग्मा </td><td> R6625 </td><td> phenol क्लोरोफॉर्म / कई बार निकाले और उपजी DEPC dH2O में resuspended और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत </td></tr><tr><td> विरोधी Digoxigenin एपी फैब टुकड़े </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> बी.एम. बैंगनी एपी सब्सट्रेट, precipitating. समाधान के लिए तैयार करने के लिए उपयोग. </td><td> अभिकर्मक </td><td> Roche </td><td> 11 074 001 442 </td><td></td></tr><tr><td> 4ml, साफ, बंद ऊपर, भंडारण शीशी सुविधा किट </td><td> आपूर्ति </td><td> राष्ट्रीय वैज्ञानिक </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> हिला एन सेंकना संकरण ओवन </td><td> उपकरण </td><td> Boekel वैज्ञानिक </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> यकीन है कि टेक बायोप्सी </td><td> आपूर्ति </td><td> Fisherbrand </td><td> 15-200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast प्लस ऊतक embedding मध्यम </td><td> अभिकर्मक </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> पील-A-Way डिस्पोजेबल प्लास्टिक ऊतक embedding molds </td><td> आपूर्ति </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrost प्लस माइक्रोस्कोप स्लाइड्स </td><td> आपूर्ति </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> परमाणु फास्ट लाल </td><td> अभिकर्मक </td><td> सिग्मा </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> 60 Cytoseal </td><td> अभिकर्मक </td><td> रिचर्ड - एलन वैज्ञानिक </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos

स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट भ्रूण में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को परिभाषित करने के लिए एक बहुत जानकारीपूर्ण दृष्टिकोण है. स्वस्थानी संकरण प्रक्रिया में लंबा है और तकनीकी रूप से कई महत्वपूर्ण कदम है कि सामूहिक रूप से अंतिम परिणाम की गुणवत्ता के लिए योगदान के साथ की मांग की. यह प्रोटोकॉल का विस्तार कई जांच लेबलिंग और प्रदर्शन के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण कदम वर्णन में कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल एक विस्तृत वर्णन प्रदान करता है महत्वपूर्ण आवश्यक कदम की reproducibly उच्च गुणवत्ता परिणाम प्राप्त करने के लिए. सबसे पहले, हम digoxygenin (डीआईजी) लेबल डीएनए पीसीआर द्वारा उत्पन्न टेम्पलेट्स विट्रो प्रतिलेखन में शाही सेना के माध्यम से जांच की पीढ़ी का वर्णन करता है. हम तीन महत्वपूर्ण assays गुणवत्ता नियंत्रण का वर्णन करने के लिए राशि, अखंडता और जांच डीआईजी लेबल की विशिष्ट गतिविधि का निर्धारण. ये कदम पर्याप्त संवेदनशीलता की एक जांच पैदा करने के लिए एक पूरी माउस भ्रूण में अंतर्जात mRNAs का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हैं.इसके अलावा, हम निर्धारण और स्वस्थानी संकरण में E8.5 E11.5 दिन पुराने माउस भ्रूण की भंडारण के लिए विधियों का वर्णन. तो, हम rehydrated संकरण की स्थिति के बाद संकरण washes और RNase गैर विशिष्ट जांच संकरण को हटाने के लिए इलाज के विवरण के बाद भ्रूण की सीमित proteinase कश्मीर पाचन के लिए विस्तृत विधियों का वर्णन. एक एंटीबॉडी एपी संयुग्मित लेबल जांच कल्पना और अंतर्जात प्रतिलिपि की अभिव्यक्ति पैटर्न प्रकट करने के लिए किया जाता है. प्रतिनिधि परिणाम सफल प्रयोगों और ठेठ suboptimal प्रयोगों से दिखाए जाते हैं.

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Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

इस पूरे माउंट<em&gt; स्वस्थानी में</em&gt; संकरण प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण कदम है कि E8.5 E11.5 दिन पुराने माउस भ्रूण में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जीन की अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों को सुनिश्चित करने के बारे में चर्चा है.

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