Name: whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede R21MH082360 (Cgcf) e R01HD056315 (NRM), così come l&#39;Università della Georgia.

1. Generazione Riboprobe via di trascrizione in vitro <ol><li> Della preparazione dei prodotti PCR per la trascrizione nei modelli in vitro. <ol><li> Progettare primer PCR con sequenze di trascrizione promotore dei fagi nelle loro estremità 5 &#39;. Nota: La sequenza promotore aggiunto 5&#39;end del senso filamento di PCR saranno utilizzati per la trascrizione della sonda senso, e la sequenza promotore aggiunto 5&#39;end del primer antisenso PCR sarà utiliz...

<ol>
	<li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues:+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization.">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li><li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA.">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li><li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development.">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li><li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo.">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pax[zf-a]:+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube.">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis/TWis+mutant+embryos.">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li><li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li><li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds.">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li><li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo:+gene+expression+in+three+dimensions.">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li><li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis,+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos.">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li><li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal.">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li></ol>

I metodi descritti in questo protocollo sono stati adattati da un certo numero di fonti diverse e ottimizzato per montare tutto E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita. Metodi per montare tutto ibridazione in situ degli embrioni dei vertebrati prima apparizione nei primi anni 1990 2,5-12. Questo protocollo è stato adattato principalmente dai metodi sviluppati per gli embrioni di Xenopus 7,8 e 2,11 del mouse. Nel nostro protocollo una grande enfasi è posta sulla valutazione ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Tipo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Digossigenina-11-uridina-5&#39;-trifosfato </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleosidi trifosfato Set </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Colonne Spin rapido per radiomarcato purificazione dell&#39;RNA </td><td> Fornitura </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasi </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA polimerasi </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 RNA polimerasi </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 μCi </td><td> Reagente </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I ricombinante, RNasi-free </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> Urea, incolore a bianco cristalli o polvere cristallina </td><td> Reagente </td><td> Pescatore </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gel di caricamento del buffer </td><td> Reagente </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> Fornitura </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> UV Stratalinker 2400 </td><td> Attrezzatura </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Eparina sodica </td><td> Reagente </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> 30% di perossido di idrogeno in acqua </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gluteraldehyde, 8% EM di grado </td><td> Reagente </td><td> Polysciences </td><td> 0 / 710 </td><td> Usare con cautela secondo le istruzioni del produttore </td></tr><tr><td> Blocco reagente </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> Fare in 5% fotografici e conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> Fai come 10 mg / ml di brodo e conservare a -20 ° C. </td></tr><tr><td> RNasi T1 </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapura Formammide </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Levamisolo cloridrato </td><td> Reagente </td><td> ICN Biomedicals. Inc </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> Acido ribonucleico dal lievito torula, tipo VI </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> R6625 </td><td> fenolo / cloroformio estratto più volte e precipitato, risospesi in DEPC-dH2O e conservati a -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digossigenina-AP frammenti Fab </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BM Viola AP substrato, precipitando. Pronto da usare soluzione. </td><td> Reagente </td><td> Roche </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4 ml, trasparente, chiuso Top, Deposito Vial Kit Convenienza </td><td> Fornitura </td><td> Scientifico nazionale </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr><td> Agitare N Bake ibridazione forno </td><td> Attrezzatura </td><td> Boekel scientifico </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> Biopsia Sure-Tek </td><td> Fornitura </td><td> Fisherbrand </td><td> 15-200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast Inoltre tessuto mezzo di inclusione </td><td> Reagente </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way e getta di plastica tessuto embedding stampi </td><td> Fornitura </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrost Inoltre Microscopio diapositive </td><td> Fornitura </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Reagente </td><td> Richard-Allan scientifico </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos

Montare tutto ibridazione in situ è un approccio molto informativo per la definizione di schemi di espressione genica negli embrioni. Le procedure di ibridazione in situ sono lunghi e tecnicamente impegnativo, con passi più importanti che insieme contribuiscono alla qualità del risultato finale. Questo protocollo descrive in dettaglio alcuni punti chiave del controllo della qualità per l&#39;etichettatura sonda l&#39;ottimizzazione e le prestazioni. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce una descrizione dettagliata dei passi fondamentali necessari per ottenere risultati di alta qualità riproducibile. In primo luogo, si descrive la generazione di digossigenina (DIG) sonde marcate nella trascrizione dell&#39;RNA tramite modelli in vitro di DNA generati mediante PCR. Ci descrivono tre saggi critici di controllo di qualità per determinare la quantità, l&#39;integrità e l&#39;attività specifica del DIG-sonde marcate. Questi passaggi sono importanti per la generazione di una sonda di sensibilità sufficiente per rilevare mRNA endogeni in un embrione di topo intero. Inoltre, si descrivono i metodi per la fissazione e lo stoccaggio di E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita per l&#39;ibridazione in situ. Poi, si descrive metodi dettagliati di limitata digestione proteinasi K degli embrioni reidratati seguita da i dettagli delle condizioni di ibridazione, di post-ibridazione lavaggi e trattamenti per eliminare RNAsi non specifici ibridazione sonda. AP-coniugato anticorpale è utilizzato per visualizzare le sonda marcata e rivelare il pattern di espressione del trascritto endogena. Risultati rappresentativi sono riportati da esperimenti di successo e tipici esperimenti non ottimale.

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Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Questo monte tutto<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; protocollo discute passaggi critici che assicurano riproducibile risultati di alta qualità per gli studi di espressione genica in E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita.

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