Name: whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00
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この作品は、NIHの助成R21MH082360（BGC）とR01HD056315（NRM）と同様にジョージア大学によってサポートされていました。

1。 インビトロ転写を介したリボ生成<ol><li> in vitroでの転写テンプレートのPCR産物を調製した。 <ol><li>その5 &#39;末端におけるファージ転写プロモーター配列を有するPCRプライマーの設計。 注：プロモーター配列は、センス鎖のPCRプライマーの5 &#39;末端に追加されたセンスプローブを転写するために使用され、アンチセンスPCRプライマーの5&#39;末端に追加され?...

<ol>
	<li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues:+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization.">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li><li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA.">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li><li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development.">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li><li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo.">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pax[zf-a]:+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube.">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis/TWis+mutant+embryos.">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li><li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li><li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds.">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li><li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo:+gene+expression+in+three+dimensions.">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li><li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis,+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos.">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li><li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal.">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li></ol>

このプロトコルで説明する方法は、さまざまなソースから適応し、ホールマウントE8.5-E11.5日齢のマウスの胚に最適化されています。脊椎動物の胚のin situハイブリダイゼーションホールマウントするための方法は、まず、1990年代初頭2,5-12で登場しました。このプロトコルは、主にアフリカツメガエル胚7,8と同様にマウス2,11のために開発された方法から脚...

<table border="1"><tbody><tr><th>名前</th><th>タイプ</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>注釈</th></tr><tr><td>ジゴキシゲニン-11-ウリジン-5&#39;-三リン酸</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td>リボヌクレオシド三リン酸セット</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td>放射性標識RNA精製用のクイックスピンカラム</td><td>供給</td><td>ロッシュ</td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNAポリメラーゼ</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 RNAポリメラーゼ</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTPは、[α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml、250μCiの</td><td>試薬</td><td>パーキンエルマー</td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNase Iを換え、RNaseフリー</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td>尿素、無色から白色の結晶又は結晶性の粉末</td><td>試薬</td><td>フィッシャー</td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングバッファー</td><td>試薬</td><td>アンビオン</td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td>ハイボンド-N +、アマシャム</td><td>供給</td><td> GEヘルスケア</td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td>紫外線Stratalinker 2400 </td><td>機器</td><td>ストラタジーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピロ炭酸ジエチル</td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム</td><tD&gt;試薬</td><td>アクロス</td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td>水中での過酸化水素30パーセント</td><td>試薬</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド、8％のEMグレード</td><td>試薬</td><td>ポリサイエンス</td><td> 0/710 </td><td>製造者の指示に従って、注意して使用すること</td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11096176001 </td><td> -20℃で、5％の株式と店に確認します</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNアーゼ</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 10109142001 </td><td>作るとして-20℃で10 mg / mlの株式や店舗</td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼT1 </td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> ULtrapureホルムアミド</td><td>試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸レバミゾール</td><td>試薬</td><td> ICNバイオメディカル。株式会社</td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td>トルラ酵母からリボ核酸、タイプVI </td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> R6625 </td><td>フェノール/クロロホルムを数回抽出し、沈殿させ、DEPC-dH2Oに再懸濁し、-20℃で保存</td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-AP Fab断片</td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BMパープルAP基質、沈殿させる。すぐに使用できるソリューションを提供します。 </td><td>試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11 44​​2 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4mLの、クリア、クローズドトップ、ストレージバイアルコンビニエンスキット</td><td>供給</td><td>国立科学</td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr&gt; <td>シェイクN焼くハイブリダイゼーションオーブン</td><td>機器</td><td> Boekel科学</td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td>検確かテック</td><td>供給</td><td> Fisherbrand </td><td> 15から200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplastプラス組織包埋媒質</td><td>試薬</td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td>ピールウェイ使い捨てプラスチック組織埋め込み型</td><td>供給</td><td>ポリサイエンス</td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrostプラス顕微鏡スライド</td><td>供給</td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td>核ファーストレッド</td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td>試薬</td><td>リチャード·アラン·サイエンティフィック</td><td> 8310から16 </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos

in situハイブリダイゼーションホールマウントは、胚における遺伝子発現パターンを定義するための非常に有益なアプローチである。 in situハイブリダイゼーションの手順で 、長く技術的に一括して最終結果の質の向上に寄与する複数の重要なステップで求められています。 このプロトコルを詳細にプローブのラベリングとパフォーマンスを最適化するためのいくつかの重要な品質管理手順を説明します。全体的に、我々のプロトコルは、詳細な説明を提供しています再現性よく高品質な結果を得るために必要な重要なステップの。まず、PCRによって生成されたDNA鋳型のインビトロ転写を介して、ジゴキシゲニン（DIG）標識RNAプローブの生成を説明します。我々は、量、整合性とDIG標識プローブの比活性を決定するために、3つの重要な品質管理検定法を説明します。これらの手順では、全体のマウス胚における内因性mRNAを検出するために十分な感度のプローブを生成するために重要である。加えて、我々はin situハイブリダイゼーションのためのE8.5-E11.5日齢のマウス胚の固定とストレージのための方法について説明します。そこで我々は、非特異的なプローブハイブリダイゼーションを削除するには、ハイブリダイゼーション条件、ハイブリダイゼーション後の洗浄とRNase処理の詳細は、続いて再水和された胚の限られたプロテイナーゼK消化のための詳細な方法について説明します。 AP標識抗体が標識されたプローブを可視化し、内因性の転写産物の発現パターンを明らかにするために使用されます。代表的な結果は、成功した実験と典型的な次善の実験から示されています。

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Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

この全体のマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションプロトコルは、E8.5、E11.5日齢のマウス胚において遺伝子発現研究のための再現性の高品質な結果を確保するための重要なステップを説明します。

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

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Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

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ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

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全マウントを使用するその場で</em分子とOrganismal生物学をリンクする>ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

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ハイスループットその場で</em胎児マウス下部尿生殖路のmRNAの発現パターンを特徴づける>ハイブリダイゼーション法

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

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ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

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RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

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蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

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High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

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高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...