Name: whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00
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이 작품은 NIH 보조금 R21MH082360 (BGC)와 R01HD056315 (NRM)뿐만 아니라 조지아 대학에서 지원했다.

1. 체외 스크립트에 통해 Riboprobe 생성 <ol><li> 체외 스크립트 템플릿에 대한 PCR 제품을 준비합니다. <ol><li> 자신의 5 &#39;끝에서 파지의 전사 프로모터 시퀀스와 디자인 PCR의 프리 머. 참고 : 발기인 순서는 의미 - 스트랜드 PCR 프라이머의 5&#39;end하는 의미 프로브를 인식에 사용됩니다 추가하고 발기인 순서는 안티센스 PCR 프라이머의 5&#39;end에 추가는 안티 - 감지 프?...

<ol>
	<li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues:+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization.">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li><li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA.">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li><li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development.">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li><li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo.">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pax[zf-a]:+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube.">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis/TWis+mutant+embryos.">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li><li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li><li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds.">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li><li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo:+gene+expression+in+three+dimensions.">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li><li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis,+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos.">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li><li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal.">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li></ol>

이 프로토콜에 설명 된 방법은 다른 소스들로부터 적응 및 전체 마운트 E8.5 - E11.5 일 이전 마우스 배아에 최적화되어 있습니다. 척추 동물의 배아의 현장 하이브리드 화에 전체 마운트하기위한 방법은 먼저 1990 년대 초 2,5-12에 나타났다. 이 프로토콜은 주로 Xenopus의 배아 7,8뿐만 아니라 마우스 2,11 용으로 개발 된 방법에서 적응되었습니다. 우리 프로토콜에서...

<table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 유형 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 코멘트 </th></tr><tr><td> Digoxigenin-11-유리 딘 - 5&#39;-삼인산 </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleoside의 삼인산 세트 </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> 방사성 동위 원소 표지 된 RNA 정화를위한 빠른 스핀 열 </td><td> 공급 </td><td> 로슈 </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA 중합 효소의 </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA 중합 효소의 </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 RNA의 효소 </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α- 32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 μCi </td><td> 시약 </td><td> Perkin 엘머 </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNase I는 재조합, RNase 무료 </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> 요소, 무색 - 투 - 흰 색 결정 또는 결정 분말 </td><td> 시약 </td><td> 어부 </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> 젤 로딩 버퍼 </td><td> 시약 </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> 공급 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> UV의 Stratalinker 2400 </td><td> 장비 </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 디 에틸 pyrocarbonate </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> 헤파린 나트륨 </td><tD&gt; 시약 </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> 물에 과산화수소 30% </td><td> 시약 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> 글루 테르 알데히드, 8퍼센트 EM 등급 </td><td> 시약 </td><td> Polysciences </td><td> 0 / 710 </td><td> 제조의 지시에 따라주의해서 사용 </td></tr><tr><td> 시약 차단 </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 11096176001 </td><td> -20 ° C에서 5 %의 주식 및 매장에 확인 </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> Rnase </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 10109142001 </td><td> 확인으로 -20 ° C. 10 MG / ML 주식 및 매장 </td></tr><tr><td> Rnase T1 </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> ULtrapure 포름 아미드 </td><td> 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Levamisole 히드로 클로라이드 </td><td> 시약 </td><td> ICN의 Biomedicals. 주식회사 </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> torula 효모에서 Ribonucleic 산성 타입 VI </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> R6625 </td><td> 페놀 / 클로로포름은 여러 번 추출 유발, DEPC-dH2O에 resuspended 및 -20 ° C에 저장 </td></tr><tr><td> 안티 Digoxigenin-AP 팹 조각 </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> precipitating BM 퍼플 AP 기판. 솔루션을 바로 사용하기. </td><td> 시약 </td><td> 로슈 </td><td> 11 44​​2 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4mL, 삭제, 휴일 탑, 스토리지 비알 편리 키트 </td><td> 공급 </td><td> 국립 과학 </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> N 베이킹 하이브 리다이 제이션 오븐 흔들어 </td><td> 장비 </td><td> Boekel 과학 </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> 그래 - 테크을 생검 </td><td> 공급 </td><td> Fisherbrand </td><td> 15-200 - 402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast 플러스 조직 퍼가기 매체 </td><td> 시약 </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> 필-A-웨이 일회용 플라스틱 조직 퍼가기 금형 </td><td> 공급 </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrost 플러스 현미경 슬라이드 </td><td> 공급 </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> 원자력 빠른 레드 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> 시약 </td><td> 리차드 - 앨런 과학 </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos

현장 하이브리드 화의 전체 마운트는 배아의 유전자 발현 패턴을 형성하기위한 매우 유익한 방법이다. 현장 하이브리드 절차에는 긴 있으며, 기술적으로 통칭 최종 결과의 질에 기여하는 여러 중요한 단계를 요구.이 프로토콜은 프로브 레이블과 성능을 최적화하기위한 세부 몇 가지 주요 품질 관리 단계에 대해 설명합니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다 필요한 중요한 단계 중 reproducibly 고품질의 결과를 얻을 수 있습니다. 첫째, 우리는 PCR에 의해 생성 된 DNA 템플릿의 체외 스크립트의를 통해 digoxygenin (파)이라는 RNA 프로브의 생성을 설명합니다. 우리는 양, 무결성 및 파 - 라벨 프로브의 특정 활동을 결정하는 세 가지 중요한 품질 관리 assays을 설명합니다. 이 단계는 전체 마우스 배아에서 내생 mRNAs를 감지하기에 충분한 감도의 프로브를 생성하기 위해 중요합니다.또한, 우리는 현장 하이브리드 화에 대한 E8.5 - E11.5 일 이전 마우스 배아의 고정 및 저장하는 방법을 설명합니다. 그런 다음, 우리는 하이브리드 조건, 사후 하이브리드 세차 및 비 특정 프로브 하이브 리다이 제이션을 제거하는 RNase 처리의 세부 정보가 rehydrated 배아의 제한 proteinase K는 소화에 대한 자세한 방법을 설명합니다. AP-복합 항체가 표시 프로브를 시각화하고 내생 성적표의 표현 패턴을 표시하는 데 사용됩니다. 대표 결과는 성공적인 실험과 일반 차선 실험에서 표시됩니다.

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Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

이 모든 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 프로토콜은 E8.5 - E11.5 일 이전 마우스 배아의 유전자 발현 연구에 대한 재현 고품질의 결과를 보장 중요한 단계를 설명합니다.

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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생물학

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

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Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

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전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 Organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

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높은 처리량 현장에서</em태아 마우스 로우어 Urogenital 트랙트의 mRNA의 표현 패턴을 특성화> 하이브리드화 방법

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

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전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

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RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

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형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

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높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...