Name: whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами NIH R21MH082360 (BGC) и R01HD056315 (NRM), а также в Университете Джорджии.

1. Riboprobe поколения в пробирке с помощью транскрипции <ol><li> Подготовка продуктов ПЦР для шаблонов в пробирке транскрипции. <ol><li> Проектирование ПЦР-праймеров с фагом транскрипции промотора последовательности в их концах 5 &#39;. Примечание: последовательность промот...

<ol>
	<li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues:+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization.">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li><li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li><li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA.">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li><li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development.">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li><li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo.">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pax[zf-a]:+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube.">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis/TWis+mutant+embryos.">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li><li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li><li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds.">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li><li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo:+gene+expression+in+three+dimensions.">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li><li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization.">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens.">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li><li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis,+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos.">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li><li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal.">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li></ol>

Методы, описанные в этом протоколе были адаптированы из ряда различных источников и оптимизированы для целого крепления E8.5-E11.5 дневных эмбрионов мыши. Методы целом крепления на месте гибридизации эмбрионов позвоночных впервые появился в начале 1990-х 2,5-12. Этот протокол был ад...

<table border="1"><tbody><tr><th> Имя </th><th> Тип </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> Дигоксигенин-11-уридин-5&#39;-трифосфат </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Установить рибонуклеозид Triphosphate </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Быстрый Столбцы Спин для меченых очистки РНК </td><td> Поставлять </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 РНК-полимеразы </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 РНК-полимеразы </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 РНК-полимеразы </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 мкКи </td><td> Реагент </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> ДНКазы I рекомбинантного, РНКазы </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> Мочевина, бесцветный до белого кристаллы или кристаллический порошок </td><td> Реагент </td><td> Рыбак </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> Гель для загрузки буфера </td><td> Реагент </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> Поставлять </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> УФ Stratalinker 2400 </td><td> Оборудование </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Диэтиловый pyrocarbonate </td><td> Реагент </td><td> Сигма </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Гепарин натрия </td><tD&gt; реагентов </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> перекись водорода 30% в воде </td><td> Реагент </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gluteraldehyde, 8% EM класса </td><td> Реагент </td><td> Polysciences </td><td> 0/710 </td><td> Используйте с осторожностью в соответствии с инструкцией завода-изготовителя </td></tr><tr><td> Блокирующий реагент </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> Убедитесь в 5% акций и хранить при -20 ° C </td></tr><tr><td> Протеиназы K </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> РНКазы </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> Сделать 10 мг / мл акции и хранить при -20 ° C. </td></tr><tr><td> РНКазы T1 </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Формамид </td><td> Реагент </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Левамизол гидрохлорид </td><td> Реагент </td><td> ICN Biomedicals. Inc </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> Рибонуклеиновой кислоты из дрожжей Torula, тип VI </td><td> Реагент </td><td> Сигма </td><td> R6625 </td><td> фенолом / хлороформом экстрагируют несколько раз и осаждают, ресуспендировали в DEPC-dH2O и хранили при -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-дигоксигенин-AP Fab фрагментов </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BM Фиолетовый AP основания, осаждая. Готовый к употреблению раствор. </td><td> Реагент </td><td> Roche </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4 мл, прозрачный, закрытый верх, хранения флаконов Convenience Kit </td><td> Поставлять </td><td> Национальный научный </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Встряхнуть N Bake гибридизации духовке </td><td> Оборудование </td><td> Boekel Научные </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> Биопсия Sure-Tek </td><td> Поставлять </td><td> Fisherbrand </td><td> 15-200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast Plus ткани вложения среде </td><td> Реагент </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way одноразовые пластиковые формы вложения ткани </td><td> Поставлять </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrost слайды Plus микроскоп </td><td> Поставлять </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> Ядерная Fast Red </td><td> Реагент </td><td> Сигма </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Реагент </td><td> Ричард Аллан Научно- </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount in situ hybridization of e8.5 to e11.5 mouse embryos

Всего крепления в гибридизация является очень информативным подходом для определения моделей экспрессии генов в эмбрионах. На месте процедуры гибридизации длительным и технически сложных с несколькими важными шагами, которые в совокупности способствуют повышению качества конечного результата. Этот протокол подробно описывает несколько ключевых контроля качества шаги для оптимизации маркировки зонда и производительности. Целом, наш протокол содержит подробное описание критических шагов, необходимых для воспроизводимо получать высококачественные результаты. Во-первых, мы описываем поколения digoxygenin (DIG) меченых зондов РНК в пробирке с помощью транскрипции ДНК шаблонов генерируется с помощью ПЦР. Мы описываем три критические анализы контроля качества, чтобы определить количество, целостность и удельной активности DIG-меченых зондов. Эти шаги являются важными для создания зонда достаточной чувствительностью для обнаружения эндогенных мРНК в целом эмбриона мыши.Кроме того, мы опишем методы фиксации и хранения E8.5-E11.5 дневных эмбрионов мыши в гибридизация. Затем мы описываем подробные описания методов для ограниченного протеиназы К переваривания регидратации эмбрионов следуют подробности условий гибридизации, пост-гибридизации моет и РНКазы обработку для удаления неспецифических зонда гибридизации. AP-конъюгированных антител используется для визуализации меченых зондов и выявить паттерн экспрессии эндогенного стенограммы. Представитель результаты показаны от успешных экспериментов и типичные оптимальным экспериментов.

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos at JoVE.com

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Вся эта гора<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизации протокола обсуждаются важнейшие шаги, которые обеспечивают воспроизводимое высокое качество результатов для исследования экспрессии генов в E8.5-E11.5 дневных эмбрионов мыши.

Всего горы<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация E8.5 в E11.5 эмбрионов мыши

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Метод полного окрашивания антител горе в Чик

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Данио рерио Всего горе высокого разрешения двумя люминесцентными В Ситу Гибридизация

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Использование Всего горе На месте Гибридизация в ссылку молекулярной биологии и организменном

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Высокая пропускная способность На месте Гибридизация метод для характеристики Шаблоны экспрессии мРНК в фетальных Мышь Нижняя урогенитального тракта

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Всего горы РНК Флуоресцентные<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

РНК<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизации эмбрионов Всего в гору и сотовых гистологии адаптированный для морских хрящевых рыб

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Высокое разрешение Всего горе<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в Эмбрионы рыбок данио изучить экспрессию генов и функции

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Анализ апоптоза у эмбрионов данио рерио по целом монтажа иммунофлуоресценции для обнаружения активированного каспазы 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...