Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

Het onderzoek dat hier werd ondersteund door de Pennsylvania Department of Health, The Ellison Medical, De V en The Emerald stichtingen.

1. Expressie van recombinant Tc TERT <ol><li> Inoculeren 6 L van 2YT media (6 x 2 L Baffled erlenmeyers met een L van 2YT bouillon in elk) van zes verse platen van Rosetta getransformeerd (DE3) pLysS cellen met de synthetische Tc TERT plasmide met een TEV splitsbare N-terminale hexahistidine- tag. </li><li> Grow-cellen bij 37 ° C onder schudden bij 220 rpm tot een OD 600 van 0,5-0,6. </li><li> Induceren eiwitexpressie door de toevoeging van 1 mM IPTG. </li><li> Verminder de temperatuur to...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

De hier gepresenteerde methode zorgt voor de productie van grote hoeveelheden van de katalytische subeenheid van T. castaneum telomerase TERT in oplosbare, actieve vorm van structurele en biochemische studies. De methode van Tc TERT over-expressie is gevoelig voor subtiele veranderingen in temperatuur of celdichtheid van de hierboven vermeld en kan drastisch invloed hebben op de niveaus van eiwitexpressie. In het bijzonder, hebben we gevonden dat het induceren van de cellen voor proteïne-expressie voo...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th></tr><tr><td> Rosetta (DE3) plysS Cellen </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT Broth </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Goud Biotechnologie </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX ultrasoonapparaat 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> Akta Purifier FPLC </td><td> GE Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA Superflow Resin </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Centrifugaal Filter Device </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> POROS 50 HS Sterke kationenuitwisselingsvermogen Verpakking </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> POROS 50 HQ Sterke kationenuitwisselingsvermogen Verpakking </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 grootte-uitsluiting Column </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Fenol: Chloroform: isoamyl 25:24:1 met 10mm Tris, pH 8, 1 mM EDTA </td><td> Sigma </td><td> P3803-100ml </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Recombinant Rnasin ribonucleaseremmer </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> DNA-oligonucleotiden </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

Inspanningen om de katalytische subeenheid van telomerase isoleren, tert, in voldoende hoeveelheden voor structurele studies, is voldaan met beperkt succes voor meer dan een decennium. Hier presenteren we methoden voor de isolatie van het recombinante Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) en de reconstructie van de actieve T. castaneum telomerase ribonucleoproteïne (RNP) complex in vitro. Telomerase is een gespecialiseerde reverse transcriptase een die korte DNA-herhalingen, de zogenaamde telomeren, aan het 3 &#39;einde van lineaire chromosomen 2 die dienen om hen te beschermen tegen end-to-end-fusion en degradatie toevoegt. Na DNA-replicatie, een kort segment verloren gaat aan het einde van het chromosoom 3 en zonder telomerase, blijven cellen te delen totdat uiteindelijk het bereiken van hun Hayflick Limit 4. Bovendien, telomerase inactief is in de meeste somatische cellen 5 bij volwassenen, maar is actief in kankercellen 6, waar het bevordert de cel onsterfelijkheid 7. De minimale telomerase enzym bestaat uit twee kerncomponenten: het eiwit subunit (tert), die de katalytische subeenheid van het enzym en een integraal RNA-component (TER), waarin de sjabloon TERT gebruikt om te synthetiseren telomeren 8,9 omvat. Vóór 2008 had alleen de structuren voor de individuele telomerase domeinen opgelost 10,11. Een belangrijke doorbraak op dit gebied kwam van de bepaling van de kristalstructuur van de actieve 12, katalytische subeenheid van T. castaneum telomerase, Tc TERT 1. Hier presenteren we methoden voor het produceren van grote hoeveelheden van het actieve, oplosbare Tc TERT voor structurele en biochemische studies, en de reconstructie van de telomerase RNP complex in vitro telomerase activiteit assays. Een overzicht van de gebruikte experimentele methode is weergegeven in figuur 1.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Inspanningen om de katalytische subeenheid van telomerase isoleren, tert, in voldoende hoeveelheden voor structurele studies, is voldaan met beperkt succes voor meer dan een decennium. Hier presenteren we methoden voor de isolatie van het recombinante Tribolium castaneum TERT (<em&gt; Tc</em&gt; TERT) en de reconstructie van de actieve<em&gt; T. castaneum</em&gt; Telomerase ribonucleoproteïne (RNP) complex<em&gt; In vitro</em&gt;.

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity DTH in Rats

Inductie en controle van Active Vertraagde overgevoeligheidsreacties (DTH) bij ratten

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-lymfocyten Capture Met behulp van een Wegwerp Microfluïdische Chip voor HIV

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analyse van de Schwann-astrocyte Interacties gebruik In Vitro Testen

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Lengte van telomeren en telomerase activiteit; Een Yin en Yang van celsenescentie

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analyse van RNA processing Reacties Met behulp van Cell Free Systems: 3 &#39;End Splitsing van pre-mRNA Substrates<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitutie van β-catenine afbraak in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Productie van Haploid zebravis embryo&#39;s door<em&gt; In Vitro</em&gt; Bemesting

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstructie van Licht-oogsten Complexen van planten en groene algen

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...