Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
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La recherche présentée ici a été soutenu par le Pennsylvania Department of Health, The Medical Ellison, le V et le Fondations d&#39;Emeraude.

1. L&#39;expression de TERT recombinante Tc <ol><li> Inoculer 6 L de 2YT médias (6 x 2 L Perplexe erlenmeyers contenant 1 litre de bouillon 2YT dans chaque) à partir de six plaques fraîches de cellules pLysS transformé Rosetta (DE3) contenant les synthétiques Tc TERT plasmide avec une TEV clivable N-terminale hexahistidine- tag. </li><li> Cultiver des cellules à 37 ° C tout en agitant à 220 rpm pour une DO 600 de 0,5-0,6. </li><li> Induire l&#39;expression de protéines en ajoutant...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

La méthode présentée ici permet de produire de grandes quantités de sous-unité catalytique de T. TERT télomérase castaneum sous forme soluble, actifs pour des études structurales et biochimiques. La méthode de Tc TERT sur-expression est sensible à des changements subtils dans la température ou la densité des cellules de ceux mentionnés ci-dessus et peut considérablement affecter les niveaux d&#39;expression de protéines. Plus précisément, nous avons constaté que les cellules ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif </th><th> Société </th><th> Nombre de catalogue </th></tr><tr><td> Rosetta (DE3) Cellules plysS </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT Bouillon </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Or la biotechnologie </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX Sonicator 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA Purificateur FPLC </td><td> GE Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Résine Superflow Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 dispositif centrifuge Filtre </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> POROS 50 HS échange de cations forts d&#39;emballage </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> POROS 50 HQ échange de cations forts d&#39;emballage </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 colonne d&#39;exclusion de taille </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Phénol: chloroforme: isoamyle 25:24:1 avec 10mm de Tris, pH 8, EDTA 1 mM </td><td> Sigma </td><td> P3803-100mL </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Recombinant inhibiteur de la ribonucléase Rnasin </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Oligonucléotides d&#39;ADN </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

Les efforts déployés pour isoler la sous-unité catalytique de la télomérase, TERT, en quantité suffisante pour des études structurales, ont été atteints avec un succès limité pendant plus d&#39;une décennie. Ici, nous présentons les méthodes pour l&#39;isolement de la protéine recombinante TERT Tribolium castaneum (Tc TERT) et la reconstitution de la T. actifs télomérase castaneum ribonucléoprotéines (RNP) complexes in vitro. La télomérase est une transcriptase inverse spécialisée qui ajoute une répétition courts d&#39;ADN, appelées télomères, à l&#39;extrémité 3 &#39;des chromosomes linéaires 2 qui servent à les protéger de bout en bout de fusion et de dégradation. Après réplication de l&#39;ADN, un court segment est perdu à l&#39;extrémité du chromosome 3, et sans télomérase, les cellules continuent divisant jusqu&#39;à ce que finalement atteint leur limite de Hayflick 4. De plus, la télomérase est en dormance dans la plupart des cellules somatiques 5 chez les adultes, mais elle est active dans six cellules cancéreuses où il favorise l&#39;immortalité cellulaire 7. L&#39;enzyme télomérase minimale se compose de deux éléments fondamentaux: la sous-unité protéique (TERT), qui comprend la sous-unité catalytique de l&#39;enzyme et une composante intégrante ARN (TER), qui contient la TERT modèle utilise pour synthétiser les télomères 8,9. Avant 2008, seules les structures pour les domaines télomérase individu avait été résolu 10,11. Une percée majeure dans ce domaine est venu de la détermination de la structure cristalline des 12 actifs, sous-unité catalytique de T. télomérase castaneum, Tc TERT 1. Ici, nous présentons les méthodes pour produire de grandes quantités de l&#39;actif, Tc TERT solubles pour des études structurales et biochimiques, et la reconstitution du complexe RNP télomérase in vitro pour les tests d&#39;activité télomérase. Un aperçu des méthodes expérimentales utilisées est montré dans la figure 1.

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Les efforts déployés pour isoler la sous-unité catalytique de la télomérase, TERT, en quantité suffisante pour des études structurales, ont été atteints avec un succès limité pendant plus d&#39;une décennie. Ici, nous présentons les méthodes pour l&#39;isolement de la protéine recombinante TERT Tribolium castaneum (<em&gt; Tc</em&gt; TERT) et la reconstitution de la population active<em&gt; T. castaneum</emRibonucléoprotéine télomérase&gt; (RNP) complexes<em&gt; In vitro</em&gt;.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

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