Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

Die Forschung hier vorgestellte wurde von der Pennsylvania Department of Health, der Ellison Medical, Der V und The Emerald Stiftungen unterstützt.

1. Expression von rekombinanten Tc TERT <ol><li> Impfen 6 L von 2YT Medien (6 x 2 L Baffled Erlenmeyerkolben mit 1 l Brühe 2YT in jeder) aus sechs frische Platten von Rosetta (DE3) transformiert pLysS Zellen mit den synthetischen Tc TERT Plasmid mit einem TEV spaltbaren N-terminalen Hexa-Histidin- -Tag. </li><li> Wachsen Zellen bei 37 ° C unter Schütteln bei 220 Upm bis zu einer OD 600 von 0,5-0,6. </li><li> Induce Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG. </li><li> Temperatur reduz...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Produktion von großen Mengen der katalytischen Untereinheit von T. castaneum Telomerase TERT in lösliche aktive Form für strukturelle und biochemische Untersuchungen. Die Methode der Tc TERT Überexpression empfindlich auf subtile Veränderungen in Temperatur oder Zelldichte von den oben dargestellten und können dramatisch beeinflussen die Höhe der Proteinexpression. Insbesondere haben wir festgestellt, dass Induktion der Zellen für die Proteinexpress...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Catalog Number </th></tr><tr><td> Rosetta (DE3) pLysS Cells </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT Broth </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Gold-Biotechnologie </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX Sonicator 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA Purifier FPLC </td><td> GE Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA Superflow Resin </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter Geräte </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> POROS 50 HS starken Kationenaustausch Verpackung </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> POROS 50 HQ starken Kationenaustausch Verpackung </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Spalte </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25:24:1 mit 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA </td><td> Sigma </td><td> P3803-100 mL </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Rekombinante RNasin Ribonucleaseinhibitor </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> DNA-Oligonukleotide </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

Die Bemühungen um die katalytische Untereinheit der Telomerase zu isolieren, TERT, in ausreichenden Mengen für strukturelle Studien haben mit begrenztem Erfolg seit mehr als einem Jahrzehnt getroffen. Hier präsentieren wir Methoden zur Isolierung des rekombinanten Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) und die Wiederherstellung der aktiven T. castaneum Telomerase ribonucleoprotein (RNP)-Komplex in vitro. Telomerase ist ein spezialisierter Reverse-Transkriptase-1, die kurze DNA-Wiederholungen, die Telomere, die 3 &#39;Ende der linearen Chromosomen 2, die ihnen von End-to-End-Fusion und Abbau zu schützen dienen hinzu. Nach DNA-Replikation, ein kurzes Segment am Ende des Chromosoms 3 und ohne Telomerase ist verloren, weiterhin Zellen, bis schließlich der Erreichung ihrer Hayflick Limit 4 geteilt. Darüber hinaus ist die Telomerase ruhend in den meisten somatischen Zellen 5 bei Erwachsenen, sondern ist aktiv in Krebszellen 6, wo es fördert Zelle Unsterblichkeit 7. Die minimale Telomerase-Enzym besteht aus zwei Kernkomponenten: die Protein-Untereinheit (TERT), welche die katalytische Untereinheit des Enzyms und ein integraler RNA-Komponente (TER), der die Vorlage TERT verwendet, um Telomere 8,9 synthetisieren enthält umfasst. Vor 2008 hatten nur Strukturen für einzelne Telomerase-Domänen 10,11 gelöst. Ein wichtiger Durchbruch auf diesem Gebiet kamen aus der Bestimmung der Kristallstruktur der aktiven 12, katalytische Untereinheit von T. castaneum Telomerase, Tc TERT 1. Hier stellen wir Verfahren zur Herstellung von großen Mengen des aktiven, löslichen Tc TERT für strukturelle und biochemische Untersuchungen, und die Wiederherstellung der Telomerase RNP-Komplex in vitro für Telomerase-Aktivität Assays. Eine Übersicht über die experimentellen Methoden ist in Abbildung 1 dargestellt.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Die Bemühungen um die katalytische Untereinheit der Telomerase zu isolieren, TERT, in ausreichenden Mengen für strukturelle Studien haben mit begrenztem Erfolg seit mehr als einem Jahrzehnt getroffen. Hier präsentieren wir Methoden zur Isolierung des rekombinanten Tribolium castaneum TERT (<em&gt; Tc</em&gt; TERT) und die Wiederherstellung der aktiven<em&gt; T. castaneum</em&gt; Telomerase ribonucleoprotein (RNP)-Komplex<em&gt; In-vitro-</em&gt;.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity DTH in Rats

Induktion und Überwachung von Active Delayed Type Überempfindlichkeit (DTH) in Ratten

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

Forschung

Biologie

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomere und Telomerase-Aktivität Länge; Ein Yin und Yang der Zellalterung

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Die Analyse der RNA-Prozessierung Reaktionen mit Handy Free Systems: 3 &#39;Ende Spaltung von prä-mRNA-Substrate<em&gt; In-vitro-</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...