Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

המחקר המוצג כאן נתמכה על ידי משרד הבריאות של פנסילבניה, רפואי אליסון, V ו יסודות אמרלד.

1. ביטוי רקומביננטי טרט Tc <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 6 L של 2YT התקשורת (6 x 2 L נבוך צלוחיות Erlenmeyer המכיל 1 ליטר של מרק 2YT בכל אחד) מתוך שש צלחות טריים של תאים pLysS הפך רוזטה (DE3) המכיל את סינתטיים Tc טרט פלסמיד עם TeV N-מסוף cleavable hexahistidine- תג. </li><li s...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

השיטה המוצגת כאן מאפשרת ייצור של כמויות גדולות של למקטע הקטליטית של ט &#39; castaneum טרט telomerase בצורת, מסיסים פעיל ללימודי מבניים ביוכימיים. השיטה של Tc טרט יתר ביטוי רגיש שינויים עדינים בטמפרטורה או צפיפות התאים מאלה כאמור לעיל יכול להשפיע באופן דרמטי את רמות ביטו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> רוזטה (DE3) plysS תאים </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT מרק </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> זהב ביוטכנולוגיה </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX Sonicator 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> אקטע מטהר FPLC </td><td> GE מדעי החיים </td><td></td></tr><tr><td> Ni-נ.ת. ע Superflow שרף </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 מכשיר סינון צנטריפוגלי </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> פורוס 50 HS-Exchange הקטיון חזקה אריזה </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> פורוס 50 HQ Exchange הקטיון חזקה אריזה </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 גודל, הרחקת טור </td><td> GE מדעי החיים </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> פנול: כלורופורם: Isoamyl 25:24:1 עם 10mm טריס, pH 8, 1mm EDTA </td><td> סיגמא </td><td> P3803-100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> רקומביננטי אינהיביטור Ribonuclease Rnasin </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> ה-DNA oligonucleotides </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט (Tc טרט) ואת הכינון מחדש של ט פעיל ribonucleoprotein castaneum telomerase (RNP) מורכב במבחנה. Telomerase הוא transcriptase הפוכה התמחה 1 המוסיפה חוזר דנ&quot;א קצרים, נקרא הטלומרים, עד הסוף &#39;3 ​​של כרומוזומים ליניארית 2 המשמשים כדי להגן עליהם מפני היתוך end-to-end והשפלה. בעקבות שכפול הדנ&quot;א, קטע קצר הוא איבד בסוף כרומוזום 3 וללא telomerase, התאים ממשיכים להתחלק עד שבסופו של דבר להגיע הגבלת Hayflick שלהם 4. בנוסף, telomerase הוא רדום ברוב התאים הסומטיים 5 אצל מבוגרים, אך היא פעילה 6 תאים סרטניים בהם הוא מקדם את אלמוות תא 7. האנזים telomerase מינימלי מורכבת משני רכיבי הליבה: למקטע החלבון (טרט), אשר כוללת את למקטע הקטליטי של האנזים ואת מרכיב בלתי נפרד RNA (TER), אשר מכיל את תבנית משתמש טרט לסנתז הטלומרים 8,9. לפני 2008, רק מבנים בודדים לתחומים telomerase נפתרו 10,11. פריצת דרך משמעותית בתחום זה בא קביעת המבנה הגבישי של 12 הפעיל, למקטע הקטליטית של ט &#39; telomerase castaneum, Tc טרט 1. כאן, אנו מציגים שיטות להפקת כמויות גדולות של טרט פעיל, Tc מסיסים ללימודי מבניים ביוכימיים, ואת הכינון מחדש של המתחם telomerase RNP במבחנה עבור מבחני פעילות הטלומרז. סקירה של שיטות ניסיוניות בשימוש מוצג באיור 1.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט (<em&gt; Tc</em&gt; טרט) ואת הכינון מחדש של פעיל<em&gt; ט castaneum</em&gt; Telomerase ribonucleoprotein (RNP) מורכב<em&gt; במבחנה</em&gt;.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity DTH in Rats

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר פעילים סוג מושהית (DTH) בחולדות

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-לימפוציטים לכידת באמצעות שבב Microfluidic פנויה ל-HIV

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

אורך הטלומרים ופעילות Telomerase; יין והיאנג של הזדקנות תא

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em&gt; במבחנה</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...