Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

अनुसंधान यहाँ प्रस्तुत स्वास्थ्य के पेंसिल्वेनिया विभाग, एलिसन मेडिकल, वी और पन्ना मूलाधार द्वारा समर्थित किया गया था.

1. पुनः संयोजक टीसी tert की अभिव्यक्ति <ol><li> Rosetta तब्दील (DE3) pLysS TEV cleavable एन टर्मिनल के साथ सिंथेटिक टीसी tert प्लाज्मिड युक्त कोशिकाओं के छह ताजा प्लेटों से 2YT मीडिया के 6 एल (6 x 2 एल प्रत्येक में 2YT शोरबा 1 एल युक्त Erlen...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

यहाँ प्रस्तुत विधि टी. के उत्प्रेरक सबयूनिट की बड़ी मात्रा में के उत्पादन के लिए अनुमति देता है castaneum घुलनशील, संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए सक्रिय रूप में टेलोमिरेज tert. टीसी से अधिक ...

<table border="1"><tbody><tr><th> अभिकर्मक के नाम </th><th> कंपनी </th><th> सूचि संख्या </th></tr><tr><td> Rosetta (DE3) plysS कक्ष </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT शोरबा </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> गोल्ड जैव प्रौद्योगिकी </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX Sonicator 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA शोधक FPLC </td><td> जीई लाइफ साइंसेज </td><td></td></tr><tr><td> नी NTA Superflow राल </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon अल्ट्रा 15 केन्द्रापसारक फ़िल्टर डिवाइस </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> POROS 50 एच एस मजबूत कटियन विनिमय पैकिंग </td><td> एप्लाइड Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> POROS 50 मुख्यालय मजबूत कटियन विनिमय पैकिंग </td><td> एप्लाइड Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 स्तंभ आकार बहिष्करण </td><td> जीई लाइफ साइंसेज </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Phenol: क्लोरोफॉर्म: 10mm Tris, पीएच 8, 1mm EDTA के साथ Isoamyl 25:24:1 </td><td> सिग्मा </td><td> P3803-100ml </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> पुनः संयोजक Rnasin Ribonuclease अवरोध करनेवाला </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy मिनी किट </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> डीएनए oligonucleotides </td><td> एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

टेलोमिरेज के उत्प्रेरक सबयूनिट को अलग करने के लिए प्रयास, tert, संरचनात्मक अध्ययन के लिए पर्याप्त मात्रा में, एक दशक से अधिक के लिए सीमित सफलता के साथ मुलाकात की है. यहाँ, हम पुनः संयोजक Tribolium castaneum tert (टीसी tert) के अलगाव और सक्रिय टी. के पुनर्गठन के लिए तरीकों वर्तमान castaneum इन विट्रो में टेलोमिरेज ribonucleoprotein जटिल (RNP). टेलोमिरेज एक विशेष रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एक है कि कम डीएनए दोहराता है, रैखिक गुणसूत्रों 2 कि उन्हें समाप्त करने के लिए अंत संलयन और गिरावट से बचाने की सेवा के 3 &#39;अंत करने के लिए telomeres कहा जाता है, कहते हैं. डीएनए प्रतिकृति के बाद, एक छोटी खंड 3 गुणसूत्र के अंत में और टेलोमिरेज के बिना खो दिया है, कोशिकाओं को अंततः उनके Hayflick सीमा 4 तक पहुँचने तक विभाजित जारी रखने के. इसके अतिरिक्त, टेलोमिरेज ज्यादातर वयस्कों में दैहिक 5 कोशिकाओं में निष्क्रिय है, लेकिन कैंसर कोशिकाओं 6 जहां यह सेल अमरता 7 को बढ़ावा देता है में सक्रिय है . प्रोटीन (tert) सबयूनिट, जो एंजाइम उत्प्रेरक सबयूनिट और एक अभिन्न शाही सेना (TER) घटक है, जो शामिल हैं टेम्पलेट tert 8,9 telomeres के synthesize करने के लिए उपयोग करता है शामिल हैं: न्यूनतम टेलोमिरेज एंजाइम दो मुख्य घटकों के होते हैं. 2008 से पहले, व्यक्तिगत टेलोमिरेज डोमेन के लिए संरचनाओं केवल 10,11 हल किया गया था. इस क्षेत्र में एक बड़ी सफलता सक्रिय 12 की क्रिस्टल संरचना का निर्धारण, टी. के उत्प्रेरक सबयूनिट से आया castaneum टेलोमिरेज, टीसी 1 tert. यहाँ, हम संरचनात्मक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए सक्रिय, घुलनशील टीसी tert, और टेलोमिरेज गतिविधि assays के लिए टेलोमिरेज इन विट्रो में RNP जटिल के पुनर्गठन की एक बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं. प्रायोगिक तरीकों का इस्तेमाल किया के एक सिंहावलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

टेलोमिरेज के उत्प्रेरक सबयूनिट को अलग करने के लिए प्रयास, tert, संरचनात्मक अध्ययन के लिए पर्याप्त मात्रा में, एक दशक से अधिक के लिए सीमित सफलता के साथ मुलाकात की है. यहाँ, हम पुनः संयोजक Tribolium castaneum tert के अलगाव के लिए तरीकों वर्तमान (<em&gt; टीसी</em&gt; Tert) और सक्रिय के पुनर्गठन<em&gt; टी. castaneum</em&gt; टेलोमिरेज (RNP) ribonucleoprotein जटिल<em&gt; इन विट्रो में</em&gt;.

सक्रिय टी. के पुनर्गठन इन विट्रो में castaneum टेलोमिरेज

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity DTH in Rats

प्रेरण और चूहे में सक्रिय विलंबित प्रकार hypersensitivity (डीटीएच) के निगरानी

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

+ टी lymphocyte कैद CD4 एचआईवी के लिए एक डिस्पोजेबल microfluidic चिप का उपयोग

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

ΓH2AX foci के Ionising विकिरण करने के लिए प्रत्युत्तर में मात्रा का ठहराव

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

विकिरण के बाद γH2AX के स्थानिक वितरण का मूल्यांकन

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

श्वान - astrocyte का उपयोग सहभागिता के विश्लेषण इन विट्रो में Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomere लंबाई और टेलोमिरेज गतिविधि, सेल बुढ़ापा की एक यिन और यांग

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

पूर्व mRNA Substrates के 3 &#39;अंत विखंडन: सेल फ्री सिस्टम का प्रयोग शाही सेना प्रसंस्करण प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण<em&gt; इन विट्रो</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Β-catenin गिरावट में के पुनर्गठन<em&gt; Xenopus</em&gt; अंडा निकालें

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

अगुणित Zebrafish भ्रूण के उत्पादन से<em&gt; इन विट्रो</em&gt; निषेचन

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

पौधों और हरी शैवाल का प्रकाश कटाई परिसर के इन विट्रो पुनर्गठन में

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...