Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
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La ricerca qui presentata è stata supportata dal Dipartimento della Salute della Pennsylvania, Il Medical Ellison, V e I fondamenti Smeraldo.

1. Espressione di ricombinante TERT Tc <ol><li> Inoculare 6 L di 2YT multimediali (6 x 2 L Perplesso beute contenenti 1 l di brodo 2YT in ciascuno) da sei piatti freschi di cellule trasformate pLysS Rosetta (DE3) contenente la sintesi Tc TERT plasmide con un TEV cleavable N-terminale hexahistidine- tag. </li><li> Crescere le cellule a 37 ° C sotto agitazione a 220 rpm in un OD 600 di 0,5-0,6. </li><li> Indurre l&#39;espressione delle proteine ​​con l&#39;aggiunta di 1 mM IPTG. </li><l...

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	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

Il metodo presentato qui permette la produzione di grandi quantità della subunità catalitica di T. castaneum TERT telomerasi nelle solubile, forma attiva per studi strutturali e biochimici. Il metodo di Tc TERT sovra-espressione è sensibile ai cambiamenti sottili di temperatura o la densità delle cellule da quelle di cui sopra e possono influenzare notevolmente i livelli di espressione della proteina. In particolare, abbiamo trovato che inducono le cellule per l&#39;espressione delle proteine ​?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Rosetta (DE3) plysS Cellule </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT brodo </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Oro Biotecnologie </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> Misonix Sonicator 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> Akta Purificatore FPLC </td><td> GE Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA Superflow Resina </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 dispositivo centrifuga Filtro </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> POROS 50 HS scambio cationico forte Imballaggio </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> POROS 50 HQ scambio cationico forte Imballaggio </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 Dimensione-esclusione Colonna </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Fenolo: cloroformio: Isoamyl 25:24:1 con 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA </td><td> Sigma </td><td> P3803-100 ml </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Ricombinante l&#39;inibitore della ribonucleasi Rnasin </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> DNA oligonucleotidi </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

Gli sforzi per isolare la subunità catalitica della telomerasi, TERT, in quantità sufficienti per studi strutturali, sono stati accolti con scarso successo da oltre un decennio. Qui, vi presentiamo i metodi per l&#39;isolamento dei ricombinanti Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) e la ricostituzione del T. attivo castaneum telomerasi ribonucleoproteina (RNP) complessi in vitro. La telomerasi è una trascrittasi inversa specialisti 1 che aggiunge ripete DNA brevi, chiamate telomeri, porre fine al 3 &#39;dei cromosomi lineari 2 che servono per proteggerli da end-to-end di fusione e di degrado. A seguito di replicazione del DNA, un breve segmento è perso alla fine del cromosoma 3 e senza telomerasi, le cellule continuare a dividere fino alla fine raggiungendo il limite Hayflick 4. Inoltre, la telomerasi è latente nella maggior parte delle cellule somatiche 5 in adulti, ma è attiva nelle cellule tumorali 6, dove si promuove l&#39;immortalità delle cellule 7. L&#39;enzima telomerasi minimo è costituito da due componenti principali: la subunità proteiche (TER), che comprende la subunità catalitica dell&#39;enzima e parte integrante di RNA (TER), che contiene il TERT modello utilizza per sintetizzare i telomeri 8,9. Fino al 2008, solo le strutture per i domini telomerasi individuo era stato risolto 10,11. Un importante passo avanti in questo campo è venuto dalla determinazione della struttura cristallina dei 12 attivi, subunità catalitica di T. castaneum telomerasi, Tc TERT 1. Qui, vi presentiamo i metodi per la produzione di grandi quantità del principio attivo, TERT solubile Tc per studi strutturali e biochimici, e la ricostituzione del complesso RNP telomerasi in vitro per analisi attività della telomerasi. Una panoramica dei metodi sperimentali utilizzati è mostrata in Figura 1.

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Gli sforzi per isolare la subunità catalitica della telomerasi, TERT, in quantità sufficienti per studi strutturali, sono stati accolti con scarso successo da oltre un decennio. Qui, vi presentiamo i metodi per l&#39;isolamento dei ricombinanti Tribolium castaneum TERT (<em&gt; Tc</em&gt; TERT) e la ricostituzione del principio attivo<em&gt; T. castaneum</em&gt; Ribonucleoproteina telomerasi (RNP) complesso<em&gt; In vitro</em&gt;.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Research

JoVE Journal

Biology

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