Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
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ここで紹介する研究は、健康のペンシルバニア部、エリソン医学、Vとエメラルドの基礎によってサポートされていました。

1。組換えTcは TERTの発現<ol><li> TEV切断可能なN -末端で合成Tcは TERTプラスミドを含む（DE3）ロゼッタ変換pLysSを細胞六新鮮なプレートから2YTメディアの6リットル（6 × 2、Lはそれぞれの2YTブイヨン1Lを含む三角フラスコをバッフル）を植菌ヒスチジン-タグ。 </li><li> 0.5から0.6のOD 600、220 rpmで振盪しながら37℃で細胞を成長させる。 </li><li> 1mMのIPTGを添加することによりタ?...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

ここで紹介する方法はT.の触媒サブユニットの大量の製造を可能にする構造的および生化学的研究のための水溶性、アクティブなフォームでcastaneumのテロメラーゼTERT。 Tcは TERTの過剰発現の方法は、上記のものから、温度や細胞密度の微妙な変化に敏感で、飛躍的にタンパク質の発現レベルに影響を与える可能性があります。具体的には、光学密度が600nmで0.5に到達する前...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>ロゼッタ（DE3）pLysSを細胞</td><td> Novagen社</td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YTスープ</td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td>ゴールドのバイオテクノロジー</td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIXソニケーター3000 </td><td> Qsonica、LLC。 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA清浄FPLC </td><td> GEライフサイエンス</td><td></td></tr><tr><td>のNi - NTA Superflowレジン</td><td>キアゲン</td><td> 30410 </td></tr><tr><td>アミコンウルトラ- 15遠心フィルターデバイス</td><td>ミリポア</td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> POROS 50 HS強陽イオン交換パッキ​​ング</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> POROS 50 HQ強陽イオン交換パッキ​​ング</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td>スーパーデックス200 300分の10サイズ排除カラム</td><td> GEライフサイエンス</td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td>フェノール：クロロホルム：10mMのトリス、pHを8、1mMのEDTAとイソアミル25:24:1 </td><td>シグマ</td><td> P3803 - 100mLの</td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td>アンビオン</td><td> AM9780 </td></tr><tr><td>組換えRnasinのリボヌクレアーゼインヒビター</td><td>プロメガ</td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td> DNAオリゴヌクレオチド</td><td>統合されたDNAの技術</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

テロメラーゼの触媒サブユニットを分離するための努力、TERTは、構造的な研究のための十分な量で、10年以上の限られた成果しかされています。ここで、我々は組換えコクヌストモドキTERT（Tcは TERT）の単離とアクティブなTの再構成のための方法を提示in vitroでcastaneumのテロメラーゼリボ核タンパク質（RNP）複合体。 テロメラーゼは、エンドツーエンドの融合や劣化から守るために役立つ線形染色体2の3&#39;末端にテロメアと呼ばれる短いDNAの繰り返しを、追加する特殊な逆転写酵素1です。 DNA複製の後、短いセグメントは3番染色体の端にとテロメラーゼなしで失われ、細胞は最終的に彼らのヘイフリック制限を4に達するまで分割し続けます。さらに、テロメラーゼは、成人のほとんどの体細胞5に休止状態ですが、がん細胞では細胞の不死7を促進する6アクティブになります。 酵素とTERTがテロメア8,9を合成するために使用するテンプレートが含まれている不可欠なRNA成分（TER）の触媒サブユニットを含むタンパク質のサブユニット（TERT）、：最小限のテロメラーゼの酵素は、2つのコアコンポーネントで構成されています。前の2008年まで、個々のテロメラーゼのドメイン用の唯一の構造は10,11を解決していた。この分野で大きなブレークスルーは、アクティブな12の結晶構造の決定、T.の触媒サブユニットから来たcastaneumのテロメラーゼ、Tcは TERT 1。 ここで、我々は、構造的および生化学的研究のためのアクティブな、水溶性のTcの TERT、およびテロメラーゼ活性のアッセイのためのin vitroでのテロメラーゼRNP複合体の再構成を大量に製造する方法を提示する。使用した実験方法の概要を図1に示されています。

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

テロメラーゼの触媒サブユニットを分離するための努力、TERTは、構造的な研究のための十分な量で、10年以上の限られた成果しかされています。ここで、我々は組換えコクヌストモドキTERT（単離するための方法を提示<em&gt; TC</em&gt; TERT）とアクティブの再構成<em&gt; T. castaneum</em&gt;テロメラーゼリボ核タンパク質（RNP）複合体<em&gt; in vitroで</em&gt;。

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Research

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Biology

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