Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
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연구는 건강의 펜실베니아학과 엘리슨 의료, V 및 에메랄드 기초에 의해 지원되었다 여기를 발표했다.

1. 재조합 TC TERT의 표현 <ol><li> TEV cleavable N - 터미널로 합성 TC TERT 플라스미드를 포함하는 (DE3) 로제타 변환 pLysS 세포 여섯 신선한 접시에서 2YT 미디어 6 패 (6 X 2 L은 각 2YT 국물 1 L를 포함 Erlenmeyer의 Flasks들을 당황하게)를 예방 hexahistidine - 태그. </li><li> 37 세포를 성장 ° C 0.5-0.6의 OD 600-220 rpm으로 흔들어 동안. </li><li> 1 ㎜의 IPTG를 추가하여 단​​백질 발현을 유도. </li><li> 30 ?...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

여기서 제시하는 방법은 T.의 촉매 subunit의 대량 생산을 허용 구조적 및 생화 학적 연구에 대한 가용성, 적극적인 형태로 castaneum의 telomerase의 TERT. TC TERT 통해 표현의 방법은 위에서 언급한 이들의 온도 또는 셀 밀도에 미묘한 변화에 민감하고 극적으로 단백질 표현의 수준에 영향을 줄 수 있습니다. 특히, 우리는 광학 밀도가 600 나노미터에서 0.5에 도달하기 전에 단백질 발현을...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 로제타 (DE3) plysS 셀 </td><td> Novagen </td><td> 70,956 </td></tr><tr><td> 2YT 맛을 </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> 골드 생명 공학 </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX Sonicator 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> 악타 정수기 FPLC </td><td> GE 생명 과학 </td><td></td></tr><tr><td> NI - NTA의 Superflow 수지 </td><td> Qiagen </td><td> 30,410 </td></tr><tr><td> Amicon 울트라 - 15 원심 필터 장치 </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> 포장 POROS 50 HS 강한 양이온 교환 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> 포장 POROS 50 HQ 강한 양이온 교환 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 3백분의 10 사이즈 - 제외 칼럼 </td><td> GE 생명 과학 </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> 페놀 : 클로로포름 : 10mM 트리스, 산도 8, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 Isoamyl 25:24:1 </td><td> 시그마 </td><td> P3803 - 100mL </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> 앰비온 </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> 재조합 Rnasin의 Ribonuclease 억제제 </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 74,104 </td></tr><tr><td> 의 DNA oligonucleotides </td><td> 통합 DNA 기술 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

telomerase의 촉매 subunit을 분리하기 위해 노력 TERT은 구조적 연구를위한 충분한 수량에 10 년 이상 제한된 성공을 만나왔다. 여기, 우리는 재조합 Tribolium castaneum TERT (TC TERT)의 분리 및 활성 T.의 reconstitution에 대한 방법을 제시 체외에서 castaneum의 telomerase의 ribonucleoprotein (RNP) 복잡한. Telomerase는 엔드 - 투 - 엔드의 융합과 파괴로부터 그들을 보호하기 위해 제공 선형 염색체 2의 3 &#39;끝에 telomeres라는 짧은 DNA의 반복을, 추가 전문 역방향 transcriptase 1입니다. DNA 복제에 따라, 짧은 세그먼트는 염색체 3의 끝에와 telomerase없이 손실, 세포는 결국 자신의 헤이 플릭 한계 4에 도달하기 전까지 나누어 진행합니다. 또한, telomerase는 성인에서 가장 체세포 5 휴면이지만, 그것이 세포 영생에게 7 증진 암세포 6 활성화됩니다. 효소의 촉매 subunit와 템플릿 TERT가 telomeres 8,9를 합성하는 데 사용하는 포함하는 필수적인 RNA 구성 요소 (터)를 구성되어 단백질 subunit (TERT) : 최소한의 telomerase 효소는 두 핵심 구성 요소로 구성되어 있습니다. 이전 2008 개별 telomerase 도메인에 대해서만 구조는 10,11을 해결했다. 이 분야에 주요 돌파구는 활성 12 결정 구조의 결정, T.의 촉매 subunit에서 온 castaneum의 telomerase, TC TERT 1. 여기서는 구조적 및 생화 학적 연구에 대한 적극적인, 용해 TC의 TERT, 그리고 telomerase 활동 assays에 대한 체외에서 telomerase의 RNP 복합 reconstitution의 대량 생산을위한 방법을 제시한다. 사용된 실험 방법의 개요는 그림 1에 표시됩니다.

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

telomerase의 촉매 subunit을 분리하기 위해 노력 TERT은 구조적 연구를위한 충분한 수량에 10 년 이상 제한된 성공을 만나왔다. 여기, 우리는 재조합 Tribolium castaneum TERT의 절연 (대한 방법을 제시<em&gt; TC</em&gt; TERT)와 활성의 reconstitution<em&gt; T. castaneum</em&gt; telomerase의 ribonucleoprotein (RNP) 복잡한<em&gt; 체외에서</em&gt;.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

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JoVE Journal

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