Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
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A pesquisa apresentada aqui foi apoiado pelo departamento de Pensilvânia da saúde, o Medical Ellison, The V e As Fundações Esmeralda.

1. Expressão de recombinante TERT Tc <ol><li> Inocular 6 L de 2YT media (6 x 2 L Intrigado Frascos Erlenmeyer contendo 1 L de caldo de 2YT em cada) de seis pratos frescos de células transformadas pLysS Rosetta (DE3) contendo o sintético Tc TERT plasmídeo com um TEV N-terminal clivável hexahistidine- tag. </li><li> Cultivar células a 37 ° C agitando a 220 rpm para um OD 600 de 0,5-0,6. </li><li> Induzir a expressão da proteína pela adição de 1 mM IPTG. </li><li> Reduzir a tempera...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

O método aqui apresentado permite a produção de grandes quantidades da subunidade catalítica de T. castaneum TERT telomerase na forma solúvel ativo para estudos estruturais e bioquímicos. O método de Tc TERT sobre-expressão é sensível a mudanças sutis na temperatura ou densidade celular daqueles acima mencionados e pode afetar drasticamente os níveis de expressão da proteína. Especificamente, nós descobrimos que as células para induzir a expressão da proteína antes de a densidade ópt...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Rosetta (DE3) Células plysS </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT Caldo </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Biotecnologia ouro </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX sonicador 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> AKTA Purifier FPLC </td><td> GE Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA Resina Superflow </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Dispositivo Centrífuga Filtro </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> POROS 50 HS de troca catiônica forte Embalagem </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> POROS 50 HQ de troca catiônica forte Embalagem </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 coluna por exclusão de tamanho- </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Fenol: Clorofórmio: 25:24:1 isoamilo com 10mM Tris, pH 8, EDTA 1mM </td><td> Sigma </td><td> P3803-100mL </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Recombinante inibidor da ribonuclease Rnasin </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Oligonucleotides DNA </td><td> Integrada DNA Technologies </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

Esforços para isolar a subunidade catalítica da telomerase, TERT, em quantidades suficientes para estudos estruturais, foram cumpridos com sucesso limitado por mais de uma década. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento do recombinante Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) ea reconstituição do T. ativos telomerase castaneum ribonucleoproteína complexos (RNP) in vitro. A telomerase é uma transcriptase reversa que adiciona uma especializados repete DNA curtas, chamadas telômeros, a extremidade 3 &#39;dos cromossomas lineares duas que servem para protegê-los de ponta a ponta-de fusão e degradação. Após a replicação do DNA, um pequeno segmento é perdido no fim do cromossomo 3, e sem telomerase, as células continuam dividindo até que finalmente atingir o seu limite Hayflick 4. Além disso, a telomerase está adormecida na maioria das células somáticas 5 em adultos, mas é ativo em células de câncer 6, onde promove a imortalidade celular 7. A enzima telomerase mínima consiste em dois componentes principais: a subunidade de proteína (TERT), que compreende a subunidade catalítica da enzima e um componente integrante RNA (TER), que contém o TERT modelo usa para sintetizar telômeros 8,9. Até 2008, apenas as estruturas de domínios telomerase indivíduo tinha sido resolvido 10,11. Um grande avanço neste campo veio a determinação da estrutura cristalina dos 12 ativos, subunidade catalítica de T. castaneum telomerase, Tc TERT 1. Aqui, apresentamos métodos para produzir grandes quantidades do ativo TERT Tc, solúvel para estudos estruturais e bioquímicos, e da reconstituição do complexo RNP telomerase in vitro para ensaios de atividade telomerase. Uma visão geral dos métodos experimental utilizado é mostrado na Figura 1.

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Esforços para isolar a subunidade catalítica da telomerase, TERT, em quantidades suficientes para estudos estruturais, foram cumpridos com sucesso limitado por mais de uma década. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento do recombinante Tribolium castaneum TERT (<em&gt; Tc</em&gt; TERT) ea reconstituição do ativo<em&gt; T. castaneum</em&gt; Ribonucleoproteína telomerase (RNP) complexo<em&gt; In vitro</em&gt;.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Research

JoVE Journal

Biology

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