Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

Исследования, представленные здесь была поддержана Пенсильвании Департамент здравоохранения, Эллисон Медицинская, V и Изумрудный фондов.

1. Экспрессия рекомбинантного Тс TERT <ol><li> Привить 6 л 2YT СМИ (6 х 2 л Расстроенный колб Эрленмейера, содержащих 1 л бульона 2YT в каждой) из шести свежих пластин преобразуется Rosetta (DE3) pLysS клеток, содержащих синтетические Тс TERT плазмиду с ТРВ расщепляемого N-терминал hexahistidine- тег. </li><li> ...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

Метод, представленный здесь позволяет производить большие объемы каталитической субъединицы Т. castaneum теломеразы TERT в растворимой, активной формы для структурных и биохимических исследований. Метод Тс TERT чрезмерное выражение чувствительны к тонким изменениям температуры ил...

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> Розетта (DE3) plysS Клетки </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT Отвар </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Золото биотехнологии </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX Sonicator 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> Akta очиститель FPLC </td><td> GE Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA Superflow Смола </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ультра-15 центробежный фильтр устройства </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> ПОРОС 50 HS Сильная катионообменная упаковки </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> ПОРОС 50 HQ Сильная катионообменная упаковки </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 гель-колонки </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Фенол: хлороформ: изоамиловый 25:24:1 10 мМ Трис, рН 8, 1 мМ ЭДТА </td><td> Сигма </td><td> P3803-100 мл </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Амбион </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Рекомбинантного ингибитора рибонуклеазы Rnasin </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> ДНК-олигонуклеотиды </td><td> Комплексная ДНК-технологий </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

Попытки изолировать каталитической субъединицы теломеразы, трет, в количествах, достаточных для структурных исследований, были встречены с ограниченным успехом уже более десяти лет. Здесь мы представляем методы для выделения рекомбинантного Tribolium castaneum TERT (Тс TERT) и восстановление активного Т. castaneum теломеразы рибонуклеопротеидных (RNP) комплекс в пробирке. Теломераза является специализированным обратной транскриптазы 1, который добавляет коротких повторов ДНК, называемые теломеры, до конца 3 &#39;линейных хромосом 2, которые служат для защиты их от конца в конец синтеза и деградации. После репликации ДНК, короткий сегмент потерял в конце хромосомы 3 и без теломеразы, клетки продолжают деления пока в конце концов достигая своего Хейфлика Предельная 4. Кроме того, теломеразы является бездействующим в большинстве соматических клеток 5 у взрослых, но принимает активное участие в раковые клетки, 6, где он способствует ячейки бессмертии 7. Минимальный фермент теломераза состоит из двух основных компонентов: белков субъединицы (трет), в состав которого входят каталитическая субъединица фермента и компонентов интегральной РНК (TER), который содержит шаблон TERT использует для синтеза теломер 8,9. До 2008 года только структуры для отдельных доменов теломеразы была решена 10,11. Прорыв в этой области пришли из определения кристаллической структуры активных 12, каталитические субъединицы Т. castaneum теломеразы, Тс TERT 1. Здесь мы представляем методы получения большого количества активных, растворимые TERT Тс для структурных и биохимических исследований, а также восстановление комплекса теломеразы RNP в пробирке для анализов активности теломеразы. Обзор экспериментальных методов, используемых показано на рисунке 1.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Попытки изолировать каталитической субъединицы теломеразы, трет, в количествах, достаточных для структурных исследований, были встречены с ограниченным успехом уже более десяти лет. Здесь мы представляем методы для выделения рекомбинантного Tribolium castaneum TERT (<em&gt; Тс</em&gt; TERT) и восстановление активных<em&gt; Т. castaneum</em&gt; Теломеразы рибонуклеопротеидных (RNP) комплекс<em&gt; В пробирке</em&gt;.

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity DTH in Rats

Индукция и мониторинг активных гиперчувствительность замедленного типа (DTH) у крыс

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-лимфоцитов Захват Использование одноразовых микрофлюидный чип на ВИЧ

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Количественная оценка γH2AX Очаги в ответ на ионизирующего излучения

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Оценка пространственного распределения γH2AX следующие ионизирующих излучений

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием In Vitro Анализы

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Длиной теломер и теломеразы, Инь и Ян клеточного старения

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Анализ РНК обработки реакций с помощью мобильного Бесплатные системы: 3 &#39;Конец расщепление пре-мРНК подложках<em&gt; В пробирке</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Восстановление β-катенина ухудшение<em&gt; Xenopus</em&gt; Яйцо Экстракт

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Производство гаплоидных эмбрионов данио по<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Оплодотворение

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Экстракорпоральное возобновлении деятельности светособирающих комплексов растений и зеленых водорослей

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...