Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
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La investigación presentada aquí fue apoyado por el Departamento de Salud de Pennsylvania, la Asociación Médica Ellison, V y Los fundamentos de esmeralda.

1. Expresión de proteínas recombinantes TERT Tc <ol><li> Inocular 6 L de 2YT los medios de comunicación (6 x 2 L Desconcertado matraces Erlenmeyer que contiene 1 l de caldo de 2YT en cada uno) de seis nuevas placas de las células transformadas pLysS Rosetta (DE3) que contiene la síntesis Tc TERT plásmido con un TEV escindibles N-terminal hexahistidina- etiqueta. </li><li> Se cultivan las células a 37 ° C mientras se agita a 220 rpm a una OD 600 de 0.5-0.6. </li><li> Inducir la expr...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

El método aquí presentado permite la producción de grandes cantidades de la subunidad catalítica de la T. castaneum TERT de la telomerasa en forma soluble y activa para realizar estudios estructurales y bioquímicos. El método de Tc TERT sobre-expresión es sensible a los cambios sutiles en la temperatura o la densidad de las células de las arriba indicadas y puede afectar dramáticamente los niveles de expresión de la proteína. En concreto, hemos encontrado que la inducción de las células pa...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Rosetta (DE3) pLysS células </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT caldo </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Oro Biotecnología </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> Misonix Sonicator 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA purificador FPLC </td><td> GE Ciencias de la Vida </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA SuperFlow resina </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Dispositivo de filtro centrífugo </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> POROS 50 SA intercambio de cationes fuerte embalaje </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> POROS 50 HQ intercambio de cationes fuerte embalaje </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 de exclusión por tamaño de columna </td><td> GE Ciencias de la Vida </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Fenol: cloroformo: isoamílico 25:24:1 con 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA </td><td> Sigma </td><td> P3803-100 ml </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Recombinante inhibidor de la ribonucleasa RNasin </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Oligonucleótidos de ADN </td><td> Integrado las tecnologías de ADN </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

Esfuerzos para aislar a la subunidad catalítica de la telomerasa, TERT, en cantidades suficientes para realizar estudios estructurales, han tenido un éxito limitado desde hace más de una década. En este sentido, los actuales métodos para el aislamiento de la recombinación del TERT Tribolium castaneum (Tc TERT) y la reconstitución de la T. activos telomerasa castaneum ribonucleoproteína (RNP) complejos in vitro. La telomerasa es una transcriptasa reversa especializada 1 que añade repeticiones cortas de ADN, llamados telómeros, al extremo 3 &#39;de los cromosomas lineales dos que sirven para protegerse de la fusión de extremo a extremo y la degradación. Después de la replicación del ADN, un segmento corto se pierde al final del cromosoma 3, y sin telomerasa, las células siguen dividiendo hasta que finalmente llegando a su límite Hayflick 4. Además, la telomerasa está inactiva en la mayoría de las células somáticas cinco en adultos, pero está presente en seis células de cáncer en la que promueve la inmortalidad celular 7. La enzima telomerasa mínima consta de dos componentes básicos: la subunidad de la proteína (TERT), que comprende la subunidad catalítica de la enzima y un componente integral de ARN (TER), que contiene el TERT plantilla utiliza para sintetizar telómeros 8,9. Antes de 2008, sólo las estructuras de los dominios individuales de la telomerasa se ​​había resuelto 10,11. Un gran avance en este campo llegó a la determinación de la estructura cristalina de los 12 activos, subunidad catalítica de la T. telomerasa castaneum, Tc TERT 1. Aquí, se presentan métodos para producir grandes cantidades de TERT activo, soluble Tc para estudios estructurales y bioquímicos, y la reconstitución del complejo RNP telomerasa in vitro para los ensayos de actividad de la telomerasa. Una visión general de los métodos experimentales utilizados se muestra en la Figura 1.

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Esfuerzos para aislar a la subunidad catalítica de la telomerasa, TERT, en cantidades suficientes para realizar estudios estructurales, han tenido un éxito limitado desde hace más de una década. En este sentido, los actuales métodos para el aislamiento de la recombinación del TERT Tribolium castaneum (<em&gt; Tc</em&gt; TERT) y la reconstitución de los activos<em&gt; T. castaneum</em&gt; Telomerasa ribonucleoproteína (RNP) complejo<em&gt; In vitro</em&gt;.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Research

JoVE Journal

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