Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

Den forskning som presenteras här stöddes av Pennsylvania Department of Health, Ellison Medical, V och grunden Emerald.

1. Expression av rekombinanta Tc TERT <ol><li> Inokulera 6 L i 2YT medier (6 x 2 L förbryllad Erlenmeyerkolvar innehåller ett L i 2YT buljong i varje) från sex färska plattor av omvandlas Rosetta (DE3) pLysS celler som innehåller syntetiska Tc TERT plasmid med en TEV cleavable N-terminal hexahistidine- tagg. </li><li> Odla cellerna vid 37 ° C under omskakning vid 220 rpm till en OD 600 på 0,5-0,6. </li><li> Framkalla protein uttryck genom att tillsätta 1 mM IPTG. </li><li> Sänk te...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

Den metod som presenteras här ger för produktion av stora mängder av den katalytiska subenheten av T. castaneum telomeras TERT i löslig, aktiv form av strukturella och biokemiska studier. Metoden av Tc TERT över-uttryck är känslig för subtila förändringar i temperatur eller celltäthet från de ovan och kan dramatiskt påverka nivåerna av protein uttryck. Specifikt har vi funnit att förmå cellerna för proteinuttryck innan den optiska densiteten når 0,5 vid 600 nm, eller sänka temperatur...

<table border="1"><tbody><tr><th> Namn på Reagens </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th></tr><tr><td> Rosetta (DE3) plysS celler </td><td> Novagen </td><td> 70.956 </td></tr><tr><td> 2YT Broth </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Guld Bioteknik </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX Sonicator 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> AKTA Purifier FPLC </td><td> GE Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA Superflow Resin </td><td> Qiagen </td><td> 30.410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Centrifugal filterapparat </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> POROS 50 HS Stark katjonbytet Packning </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> POROS 50 HQ Stark katjonbytet Packning </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 storleksseparationskromatografi Kolumn </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Fenol: Kloroform: Isoamyl 25:24:1 med 10mm Tris, pH 8, 1mm EDTA </td><td> Sigma </td><td> P3803-100mL </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Rekombinant Rnasin ribonukleasinhibitor </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74.104 </td></tr><tr><td> DNA oligonukleotider </td><td> Integrerad DNA-teknik </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

Arbetet med att isolera den katalytiska subenheten av telomeras, TERT, i tillräckliga kvantiteter för strukturella studier, har haft en begränsad framgång i mer än ett decennium. Här presenterar vi metoder för isolering av den rekombinanta Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) och beredning av den aktiva T. castaneum telomeras ribonucleoprotein (RNP) komplex in vitro. Telomeras är en specialiserad omvänt transkriptas 1 som ger korta DNA-upprepningar, som kallas telomerer, till 3 &quot;slutet av linjära kromosomer 2 som syftar till att skydda dem från end-to-end-fusion och nedbrytning. Efter DNA-replikation, är ett kort segment förlorat i slutet av kromosom 3 och utan telomeras, fortsätter cellerna att dela tills slutligen nå sin Hayflick Limit 4. Dessutom är telomeras vilande i de flesta kroppsceller 5 hos vuxna, men är aktiv i cancerceller 6 när det främjar cellen odödlighet 7. Den minimala telomeras enzym består av två huvudkomponenter: proteinet subenheten (tert), som omfattar den katalytiska subenheten av enzymet och en integrerad RNA-komponenten (TER), som innehåller mallen TERT använder för att syntetisera telomerer 8,9. Före 2008 hade endast strukturer för enskilda telomeras domäner lösts 10,11. Ett stort genombrott inom detta område kom från bestämning av kristallstrukturen av den aktiva 12-, katalytisk subenhet T. castaneum telomeras, Tc TERT 1. Här presenterar vi metoder för att producera stora mängder av de aktiva, lösligt Tc TERT för strukturella och biokemiska studier, och beredning av telomeras RNP-komplex in vitro-analyser telomerasaktivitet. En översikt över den använda experimentella metoder visas i figur 1.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Arbetet med att isolera den katalytiska subenheten av telomeras, TERT, i tillräckliga kvantiteter för strukturella studier, har haft en begränsad framgång i mer än ett decennium. Här presenterar vi metoder för isolering av den rekombinanta Tribolium castaneum TERT (<em&gt; TC</em&gt; TERT) och beredning av den aktiva<em&gt; T. castaneum</em&gt; Telomeras ribonucleoprotein (RNP) komplex<em&gt; In vitro</em&gt;.

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity DTH in Rats

Induktion och övervakningen av en aktiv Fördröjda överkänslighetsreaktioner (DTH) hos råttor

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-lymfocyter ta med en engångs Mikroflödessystem Chip för HIV

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kvantifiering av γH2AX Foci som svar på joniserande strålning

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Utvärdering av den geografiska fördelningen av γH2AX efter joniserande strålning

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analys av Schwann-astrocyternas interaktioner Använda In Vitro Analyser

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomerlängd och telomerasaktivitet, A Yin och Yang av cellåldrande

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analys av RNA Processing Reaktioner Använda Cell Free Systems: 3 &#39;End Cleavage av Pre-mRNA-substrat<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Rekonstitution av β-catenin nedbrytning i<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Utdrag

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Produktion av Haploid Zebrafish embryon från<em&gt; In Vitro</em&gt; Befruktning

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In vitro Beredning of Light-skörd Komplex av växter och gröna alger

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...