Name: in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

Pennsylvania Sağlık Bölümü, Ellison Tıp, V ve The Emerald Vakıflar tarafından desteklenen araştırma sundu.

1. Rekombinant Tc TERT Açıklanması <ol><li> TEV cleavable N-terminali ile sentetik Tc TERT plazmid içeren (de3) Rosetta dönüştürülmüş pLysS hücreleri altı taze plakalardan 2YT medya 6 L (6 x 2 L 1 L 2YT suyu içeren her Erlenmeyer şişeler şaşkın) İnokülasyon hexahistidine etiket. </li><li> 37 ° hücrelerin büyümesine ° C ise 0.5-0.6, OD 600 220 rpm sallayarak. </li><li> 1 mM IPTG ekleyerek protein ifadesi neden. </li><li> 30 sıcaklığını azaltın ° C, 150 rpm s...

<ol>
	<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT.">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts.">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li><li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts.">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres:+no+end+in+sight.">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li><li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer.">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li><li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells.">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity.">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li><li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis.">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li><li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase.">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li><li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase:+implications+for+RNA+recognition+and+binding.">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li><li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA.">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li></ol>

Burada sunulan yöntemi büyük miktarlarda T. katalitik subunit üretim için izin verir çözünür, yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için aktif olarak castaneum telomeraz TERT. Tc TERT üzerinden ifade yöntemi yukarıda belirtilen sıcaklık ya da hücre yoğunluğu ince değişikliklere duyarlı ve protein ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde etkileyebilir . Özellikle, biz optik yoğunluğu 600 nm&#39;de 0.5 ulaşmadan önce protein ekspresyonu hücreleri indükleyen ya da sıc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> Rosetta (de3) plysS Hücreler </td><td> Novagen </td><td> 70956 </td></tr><tr><td> 2YT Broth </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Altın Biyoteknoloji </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX sonikatör 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> Akta Arıtma FPLC </td><td> GE Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA Superflow Reçine </td><td> Qiagen </td><td> 30410 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Cihaz </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> Ambalaj Poros 50 HS Güçlü Katyon Değişim </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> Ambalaj Poros 50 HQ Güçlü Katyon Değişim </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 10/300 Boyut Dışlama Sütun </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> Fenol: Kloroform: 10mM Tris, pH: 8, 1mm EDTA ile izoamil 25:24:1 </td><td> Sigma </td><td> P3803-100 ml </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Rekombinant Rnasin Ribonükleaz İnhibitörü </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> DNA oligonükleotidler </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of the active t. castaneum telomerase

Telomeraz katalitik altbirim izole etmek için çabalar, TERT, yapısal çalışmalar için yeterli miktarda, bir on yıl daha sınırlı bir başarı ile yerine getirildiğini var. Burada, rekombinant Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) izolasyonu ve aktif T. sulandırıldıktan yöntemleri mevcut in vitro castaneum telomeraz ribonükleoprotein (RNP) karmaşık. Telomeraz, bir uçtan-uca füzyon ve bozulmaya karşı korumak için hizmet doğrusal kromozomların 2 3 &#39;sonuna kadar, telomer denilen kısa DNA tekrarlar, ekleyen özel bir ters transkriptaz 1. DNA replikasyonu takiben, kısa segment 3 kromozom sonunda kaybolur ve telomeraz olmadan sonunda kendi Hayflick Sınırı 4 ulaşana kadar, hücre bölünmesi devam eder. Ayrıca, telomeraz yetişkinlerde en somatik hücre 5 içinde uyuyan, ancak kanser hücreleri, hücre ölümsüzlük 7 teşvik 6 aktif . Enzimin katalitik alt birim ve şablon TERT telomer 8,9 sentezlemek için kullandığı içeren ayrılmaz bir RNA bileşeni (TER), oluşan protein altbirim (TERT), minimal telomeraz enzimi iki temel bileşenden oluşmaktadır. 2008&#39;den önce, ayrı ayrı telomeraz etki alanları için sadece yapıları 10,11 çözüldü. T. katalitik altbirim aktif 12 kristal yapının belirlenmesi, bu alanda büyük bir atılım geldi castaneum telomeraz, Tc TERT 1. Burada, yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için aktif, çözünür Tc TERT ve telomeraz aktivitesi testleri için in vitro telomeraz RNP kompleks sulandırıldıktan büyük miktarlarda üretmek için yöntemler sunuyoruz. Kullanılan deneysel yöntemler hakkında genel bir bakış Şekil 1&#39;de gösterilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase at JoVE.com

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Telomeraz katalitik altbirim izole etmek için çabalar, TERT, yapısal çalışmalar için yeterli miktarda, bir on yıl daha sınırlı bir başarı ile yerine getirildiğini var. Burada, rekombinant Tribolium castaneum TERT izolasyonu (yöntemleri mevcut<em&gt; Tc</em&gt; TERT) ve aktif sulandırıldıktan<em&gt; T. castaneum</em&gt; Telomeraz ribonükleoprotein (RNP) karmaşık<em&gt; In vitro</em&gt;.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats

Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity DTH in Rats

Sıçanlarda Aktif Gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH) İndüksiyon ve İzlenmesi

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann-astrosit Etkileşimleri Analizi In Vitro Tahliller

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Pre-mRNA Substratlarm 3 &#39;End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Β-katenin Bozulması Of Sulandırma<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta Özü

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...