Name: visualization of the interstitial cells of cajal (icc) network in mice
Uploaded: 2011-07-27T12:00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسرطان (K08CA140946 ، لYC) ، (5F32CA130372 ، لPC) ، (وR01CA102774 R01HL055748 لPB) ، وزارة الدفاع (PC094302 لYC) ، وصندوق عائلة شومان للبحوث GIST (ل PC) ، واتحاد السرطان ستار (لأجهزة الكمبيوتر ، البطاقة الصفراء ، وCLS PB). نود أن نشكر كاتيا MANOVA ، فان نينغ ، وMesurh تركيكول من MSKCC الجزيئية علم الخلية الأساسية للحصول على مساعدة مرفق مع cryosectioning وimmunostaining.

1. تشريح الجهاز الهضمي المسالك الماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت الرحيم الفئران قبل الإرشادات IUCAC المحلية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس كل طرف على سطح الستايروفوم وشطف السطح البطني مع الايثانول 70 ٪. فتح التجويف البطني مع شق خط الوسط طويلة من الحجاب الحاجز لالعانة. جعل واحدة في قطع المريء القاصي وخفض ثان في الأمعاء الكبيرة القاصي وإزالة الجهاز الهضمي من المعدة إلى فتحة الشرج ان الكتلة ، وقطع بعناية الأربطة في العفج والأعور باستخدام مقص صغير. مكان غي المسالك في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني. تشريح بعيدا مساريق باستخدام الملقط (الشكل 1). لفصل المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة ، وقطع على بوابة المعدة وتقاطع اللفائفية. شطف لمعة من كل جزء من الجهاز الهضمي مع برنامج تلفزيوني باستخدام حقنة 5ml المرفقة إبرة التغذية (أقدم الفئران) أو إبرة حادة (الفئران الأصغر سنا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة على طول الحدود المساريقي. قطع قطعتين لكل جزء من الجهاز الهضمي ، واحدة لرؤية جبل بأكمله واحد لcryosection. </li></ol> 2. كله إعداد العينات وجبل immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطعة كاملة من كل جزء من الجهاز الهضمي في أنبوب الطول 1.5 microfuge مليئة 1.0 مل من الاسيتون وعينات الجليد الباردة إصلاح ما لا يقل عن 1 ساعة بمعدل 4 درجات مئوية. قد يتم تخزين العينات لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع -20 درجة مئوية. نحن عادة تخزين العينات في الأسيتون ، والشروع في إعداد cyrosections. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2X غسل العينة مع برنامج تلفزيوني. عينة مكان في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني. تحت تشريح miscroscope ، كشط الطبقة المخاطية بعناية قبالة مع مشرط من خلال عقد واحد نهاية مع زوج من ملاقط ، وترك العضلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن خفض العضلات الى قطع 5mm لتلطيخ مع الأجسام المضادة المختلفة. لا تقم بتخزين أكثر من 2 في برنامج تلفزيوني قبل أيام تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أن يتم منع وحضانة الخطوات في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا أو في أنبوب microfuge 1.5ml. كتلة مع 0.5 مل من حجب العازلة (5 ٪ مصل الماعز ، و 0.1 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة بمعدل 4 درجات مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في حجب العازلة وتناوب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. وقد استخدمنا بنجاح ACK - 2 المضادة للمجموعة الفئران والأرانب مكافحة Ano1 ، والأرانب لمكافحة الأجسام المضادة للPgp9.5 immunostaining جبل بأكمله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليغسل 2X 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني على محور دوار في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مخففة في المخزن حظر لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على محور دوار. نستخدم عادة اليكسا فلور 488 المضادة للأرنب وفلور اليكسا 594 مكافحة الفئران الأضداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل لمدة 15 دقيقة مع برنامج تلفزيوني على 3X المدورة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل على الشريحة ، جنبا مصلوي على رأس لضمان توجيه الأنسجة خلال الفحص المجهري. وسوف يضمن هذا التوجه الجانب مصلوي لمواجهة ساترة ويكون واجه أول ما ركز المرء في الشريحة على المجهر. نفعل ذلك على مجهر تشريح. في بعض الأحيان ، نقوم بدراسة لفترة وجيزة في النسيج تحت المجهر مضان لتوجيه صحيح. تحت المجهر مضان لتصور مجموعة أو Ano1 ، ينبغي للمرء أن تواجه ICC - MY أول شبكة من جانب ساترة. المقبل ، نضح PBS أكبر قدر ممكن من دون تجفيف تماما. إضافة 50 ميكرولتر مجموعة من وسائل الإعلام من الصعب تركيب (نستخدم إطالة الذهب) ، وبلطف مكان زلة تغطية على رأس الأنسجة. يسمح وضع تصاعد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة والشرائح في مخزن -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للفحص المجهري ، استخدمنا المجهر حقل واسع مع Z - محرك الأقراص. سواء كنا هدفا الهواء 20X (NA 0.75 ، لامزيغ الخطة) أو 60X الهدف النفط (NA 1.4 ، لامزيغ الخطة) واستغرق 2 ميكرومتر أو 1 ميكرون Z - المقاطع التي تغطي كامل العضلية. وكان في وقت لاحق deconvoluted الصور باستخدام برنامج Autoquant deconvolution. بدلا من ذلك ، وقد استخدمت العديد من الآخرين المجهري متحد البؤر بدلا من ذلك مع نتائج مماثلة. </li></ol> 3. إعداد وCryosection immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل جزء من الجهاز الهضمي ، جنبا مصلوي أسفل ، مسطحة على ورق التصفية. قطع ورقة تصفية حول الانسجة. نسيج مكان على ورقة تصفية في بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني (ونحن تمييع بارافورمالدهيد 32 ٪ في قنينة مغلقة في برنامج تلفزيوني قبل استخدام الحق) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ويمكن أن يتم التثبيت في 6 -- 12 أو إضافة لوحة اعتمادا على حجم الأنسجة ، أو في أنبوب 1.5 مل microfuge. إذا فعلت في لوحة ، parafilm لتقليل التعرض PFA. أوقات أطول قد يؤدي إلى تثبيت اخفاء مستضد ، لا سيما بالنسبة للأجسام المضادة لمكافحة كيت ACK - 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنسجة من PFA ومكان في السكروز 30 ٪ في برنامج تلفزيوني. تسمح الأنسجة لتغرق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن مع الأنسجة نسبة 1:1 من السكروز 30 ٪ و أكتوبر لمدة 1 ساعة. ثم يشن الأنسجة عموديا في cryomold مليئة أكتوبر المحور الطولي للالجهاز الهضمي وينبغي بالتوازي مع cyrosections. عند دراسة الفئران مع المورثات مختلفة أو مع علاجات مختلفة ، قد يكون من المفيد لتركيب الأنسجة المختلفة من الفئران على نفس cryomold لضمان المعالجة المتوازية. تجميد الثلج الجاف ووضعه في الثلاجة -80 درجة مئوية للتخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ميكرومتر قطع cryosectionsعلى الشريحة وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية. نقطع عادة قسمين لكل شريحة. علينا أيضا أن أداء عادة H &amp; E تلون cryosection شريحة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالمناعي ، يوازن first الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم رسم دائرة حول الأنسجة باستخدام القلم PAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة مع 150 ميكرولتر من حجب العازلة (نفس لimmunostaining جبل بأكمله) لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح عازلة تمنع وإضافة 150 الضد الأولية ميكرولتر المخفف في منع احتضان العازلة والمبيت في غرفة 4 في ترطيب درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 غسل 2X دقيقة مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف في عرقلة العازلة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نستخدم عادة اليكسا 488 المضادة للأرنب واليكسا 594 أضداد الفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل لمدة 15 دقيقة 3X مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الشريحة دون تجفيف تماما الأنسجة. إضافة قطرة من الصعب ضبط وسائل الاعلام مع تصاعد دابي (نستخدم إطالة الذهب) ومكان # 1.5 ساترة. الشريحة مكان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها لتعيين وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور ثلاثية مضان به دابي ، FITC ، وتكساس الأحمر مجموعات التصفية. </li></ol> 4. ممثل النتائج : هنا ، فإننا نستخدم الأمعاء الغليظة كمثال على ذلك. H &amp; E وصمة عار على السكروز المحمية ثابتة القسم المجمدة المستخدمة لالمناعي تظهر بعض القطع الأثرية مقارنة مع مرجع القسم البارافين (الشكل 2) ، حيث الخط الأصفر demarks الضفيرة العضلية المعوية بين طبقات العضلات الدائرية والطولية وdemarks الخط الأخضر الحدود بين الغشاء المخاطي وmuscularlis. دراسة cryosection ، من الغشاء المخاطي لالمصلية ، كنت أول لقاء للأرق العضلات الطولية (LM) تليها طبقة أكثر سمكا من طبقة دائرية (CM) في العضلات. وينبغي أن يكون في المقطع بالتوازي مع العضلات الطولية لذلك ينبغي أن يكون نوى LM ممدود إلى حد ما في حين أن من نوى CM ينبغي أن تكون صغيرة ومستديرة. وبين LM CM هي plexi العضلية المعوية مصنوعة من الخلايا العصبية التي صمة عار مع Pgp9.5. Pgp9.5 أيضا البقع العمليات العصبية في جميع أنحاء CM. والمحكمة الجنائية الدولية العضلية المعوية الشبكة (ICC - MY) تحيط الضفيرة العضلية المعوية ومصنوعة من خلايا متعدد الأقطاب. داخل طبقة العضلات الطولية ، وهناك غرفة التجارة الدولية نادرة العضلي (ICC - IMS) التي تعمل في خلايا القطبين بالتوازي مع العضلات. داخل الطبقة العضلية الدائرية ، وهناك وفرة ICC - الرسائل الفورية التي هي أيضا خلايا ثنائية القطب التي تعمل بالتوازي مع العضلات الدائرية وعبر مقطوع مع هذا الخفض. عند تقاطع للالعضلية وتحت المخاطية ، وشبكة تتألف من المحكمة الجنائية الدولية تحت المخاطية ICC - SMPS هو عبارة عن شبكة مسطحة من غرفة التجارة الدولية متعدد الأقطاب. دراسة مجموعة كاملة تحميل immunostaining من الأمعاء الغليظة ، وينبغي للمرء أن يتوقع أن تواجه المحكمة الجنائية الدولية ، أول شبكة MY ، ثم ICC - IM من CM ، وشبكات ICC - SMP ، باعتبارها واحدة من يركز ساترة (Figure. 3) . وقد وصفت قياس الحجمي الشبكات باستخدام المحكمة الجنائية الدولية لإعادة الإعمار 3D كله يشن الصور 10. باستخدام المجهر حقل واسع ، ليس هناك كبير خارج الطائرة مضان في الصور الخام التي يمكن إزالتها بعد deconvolution (الشكل 3). سوف ناقصة تجريد الغشاء المخاطي في مضان الخلفية نتيجة عالية. ANO1 آخر هو علامة على المحكمة الجنائية الدولية ، وشارك في immunostaining من كيت وANO1 يظهر التداخل الكامل للتلوين للمحكمة الجنائية الدولية (الشكل 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. الممثل تشريح الجهاز الهضمي الماوس ، وأعيد طبعه بإذن 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2 ألف) الممثل H &amp; E تلطيخ من الأمعاء الماوس كبيرة من cryosections استعداد كما هو موضح جزءا لا يتجزأ من البارافين ومرجعية المقطع تظهر بعض القطع الأثرية انكماش cryosections. وdemarks الخط الأصفر الضفيرة العضلية المعوية والخط الازرق الفاصل بين الغشاء المخاطي من العضلية. ب) الممثل كيت (أحمر ، ACK - 2) وPgp9.5 (الخضراء) المناعي مزدوجة مع counterstaining (الأزرق) دابي من الأمعاء الماوس كبيرة. LM : طولية CM العضلات : العضلات الدائرية. مقياس شريط 20 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. الممثل كيت (أحمر ، ACK - 2) كله يشن المناعي من نفس الحقل على ثلاث طائرات التنسيق ، وICC - MY الطائرة على الحدود LM / CM ، الطائرة ICC - IM في CM ، والمحكمة الجنائية الدولية. SMP الطائرة على الحدود CM / مخاطية. وتظهر الصور والصور deconvoluted الخام. مقياس شريط 20 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. الممثل المزدوج المناعي من Ano1 (الخضراء) وكيت (أحمر ، ACK - 2) في الأمعاء الغليظة. مقياس شريط 20 ميكرون.

<ol>
	<li>Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+case+for+interstitial+cells+of+Cajal+as+pacemakers+and+mediators+of+neurotransmission+in+the+gastrointestinal+tract.">A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).</li><li>Ward, S. M., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+interstitial+cell+of+Cajal:+from+bench+to+bedside.+I.+Functional+development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal+networks.">Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).</li><li>Komuro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+gastrointestinal+tract.">Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract.</a> J Physiol. 576, 653-658 (2006).</li><li>Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal.">Development and plasticity of interstitial cells of Cajal.</a> Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).</li><li>Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+proto-oncogene+c-kit+blocks+development+of+interstitial+cells+and+electrical+rhythmicity+in+murine+intestine.">Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine.</a> J Physiol. 480, 91-97 (1994).</li><li>Huizinga, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W/kit+gene+required+for+interstitial+cells+of+Cajal+and+for+intestinal+pacemaker+activity.">W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity.</a> Nature. 373, 347-349 (1995).</li><li>Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumour.">Gastrointestinal stromal tumour.</a> Lancet. 369, 1731-1741 (2007).</li><li>Hirota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+of+c-kit+in+human+gastrointestinal+stromal+tumors.">Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors.</a> Science. 279, 577-580 (1998).</li><li>Chi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETV1+is+a+lineage-specific+survival+factor+in+Gastrointestinal+Stromal+Tumour+(GIST).">ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST).</a> Nature. , (2010).</li><li>Kwon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+structure+and+function+of+ICC+networks+in+ICC+hyperplasia+and+gastrointestinal+stromal+tumors.">Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors.</a> Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).</li><li>Hwang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+anoctamin+1/TMEM16A+by+interstitial+cells+of+Cajal+is+fundamental+for+slow+wave+activity+in+gastrointestinal+muscles.">Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles.</a> J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).</li><li>Gomez-Pinilla, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ano1+is+a+selective+marker+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).</li><li>Sommer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وتميزت في البداية الخلايا الخلالي من كاجال بواسطة y سانتياغو كاجال Ramóón احد بالضبط منذ القرن باستخدام كرومات الميثيلين البقع الزرقاء والفضية والعضلية المعوية. كاجال كان يعتقد في البداية كانت المحكمة الجنائية الدولية استنادا إلى عمليات الخلايا العصبية التي هي تذكرنا المحاور والتشعبات. على مدى العديد من السنوات التي تلت ذلك ، كان محدودا دراسة البيولوجيا المحكمة الجنائية الدولية بسبب الافتقار إلى علامات معينة حتى اكتشاف أن KIT ليس فقط هو المعبر عنها في المحكمة الجنائية الدولية ، ولكن مطلوب أيضا من أجل تنميتها 6. منذ ذلك الحين ، كيت المناعي تستخدم على نطاق واسع في دراسة علم الأحياء للمحكمة الجنائية الدولية ، وأدى أيضا إلى تقدير المحكمة الجنائية الدولية في أجهزة أخرى مثل تقلص المثانة البولية. مؤخرا ، تم التعرف ANO1 كمؤشر موثوق بها المحكمة الجنائية الدولية الثانية. كانت هناك العديد من المنشورات على مدى السنوات ال 15 الماضية المناعي باستخدام المحكمة الجنائية الدولية لتحديد التثبيت باستخدام تقنيات مختلفة ومتزايدة. يعمل أفضل مقارنة بين أيدينا &quot;ثابتة المجمدة&quot; cryosections التي تم مسبوقة مع بارافورمالدهيد والسكروز المحمية لالأسيتون أو بارافورمالدهيد بعد التثبيت بعد cryosectioning. ليتصاعد كله ، وجدنا أن التثبيت الأسيتون تليها تشريح المخاطية يعطي نتائج أكثر قوة. تاريخيا ، كان ACK - 2 على الضد من أدوات الاختيار للماوس للمحكمة الجنائية الدولية تحديد الهوية. وهو فأر وحيدة النسيلة التي تعترف المجال خارج الخلية ، وإنما هو أيضا الأجسام المضادة التي تسبب عرقلة علوص عندما تعطى للعيش الفئران. ومع ذلك ، هو تدمير ببطء حاتمة ACK - 2 قبل تثبيت بارافورمالدهيد وليس انقاذ القياسية أساليب استرجاع مستضد. لقد وجدنا أن حاتمة ACK - 4 وأكثر مقاومة للبارافورمالدهيد التثبيت. بالمقارنة مع الكتل المجمدة الثابتة والمقاطع ، وكتل البارافين وجزءا لا يتجزأ من أفضل المقاطع يحفظ التشكل وأكثر استعدادا للأرشفة على المدى الطويل (الشكل 4). وقد لا ACK - 2 أو 4 - ACK استخدمت بنجاح في أقسام البارافين. اتسمت أننا D13A2 ، وهو جسم الأرنب جديدة وحيدة النسيلة ، ويعمل جيدا بصورة استثنائية في كل من الأبواب الثابتة والمجمدة البارافين من الجهاز الهضمي. وأعرب عن عدة في العديد من أنواع الخلايا الأخرى ، بما فيها الخلايا الصباغية ، والخلايا المكونة للدم ، والخلايا الجرثومية ، وخاصة في الخلايا البدينة والتي توجد أيضا في الجهاز الهضمي. لحسن الحظ ، وجدت معظم الخلايا البدينة والغشاء المخاطي وليس في العضلية. يمكن تلوين مزدوجة مع الأرنب Ano1 المضادة للطائرات ومضادة للمجموعة الفئران القضاء غير محددة تلطيخ كل الأضداد (الشكل 4). ومن الجدير بالذكر أيضا أن التعبير النسبية لكيت وAno1 بين الفئات الفرعية للمحكمة الجنائية الدولية يبدو مختلفا. على سبيل المثال ، في الأمعاء الدقيقة ، وتلطيخ كيت هو أكثر من ذلك بكثير مكثفة في المحكمة الجنائية الدولية العضلية المعوية بالمقارنة مع المحكمة الجنائية الدولية من الضفيرة العضلية العميقة في حين Ano1 تلطيخ مشابه.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> مكافحة الفئران كيت الأضداد (استنساخ ACK - 2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> استخدامها في 2μg/ml. فقد حاتمة مع overfixation. </td></tr><tr><td> مكافحة الفئران كيت الأضداد (استنساخ ACK - 4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> استخدامها في 2μg/ml. </td></tr><tr><td> أرنب المضادة للأجسام المضادة KIT (استنساخ D13A2) </td><td> خلية اشارة </td><td> 3074 </td><td> استخدامها في التخفيف 1:100. الأضداد الوحيدة المدرجة هنا أن يعمل بشكل جيد في أقسام البارافين. </td></tr><tr><td> أرنب المضادة للأجسام المضادة Pgp9.5 </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> التسميات السيتوبلازم الخلية العصبية. مفيدة لوسم الخلايا العصبية في الضفيرة العضلية المعوية. 1:1000 استخدامها في التخفيف. </td></tr><tr><td> أرنب المضادة للأجسام المضادة Ano1 </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> استخدامها في 2μg/ml </td></tr><tr><td> الكسا فلور 594 ماعز مكافحة الفئران مفتش </td><td> Invitrogen </td><td> A - 11007 </td><td> استخدامها في 2μg/ml </td></tr><tr><td> الكسا فلور 488 الماعز المضادة للأرنب مفتش </td><td> Invitrogen </td><td> A - 11008 </td><td> استخدامها في 2μg/ml </td></tr><tr><td> تغذية الحيوان الإبرة </td><td> الصياد </td><td> 01-208-87 </td><td> يميل السيليكون إبرة مفيدة للبيغ الجهاز الهضمي من الفئران الكبار </td></tr><tr><td> إبرة حادة </td><td> بيكتون Dickison </td><td> 305180 </td><td> إبرة حادة مفيدة للبيغ الجهاز الهضمي في مرحلة ما قبل الفطام الجراء </td></tr><tr><td> إطالة كاشف الذهب antifade مع دابي </td><td> Invitrogen </td><td> P - 36931 </td><td> قد تستخدم بديلا من الصعب وضع وسائل الإعلام المتصاعد مع دابي </td></tr><tr><td> نسيج تيك Cryomold </td><td> نسيج تيك </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> نسيج تيك أكتوبر </td><td> نسيج تيك </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 32 ٪ لامتصاص العرق (10ML أمبولة مختومة) </td><td> EM العلوم </td><td> 15714 </td><td> مختومة أمبولة مفتوحة وتمييع إلى 4 ٪ فقط قبل استخدامه </td></tr><tr><td> حظر العازلة </td><td></td><td></td><td> 5 ٪ مصل الماعز ، و 0.1 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني </td></tr></tbody></table>

visualization of the interstitial cells of cajal (icc) network in mice

الخلايا من خلالي كاجال (ICC) هي مشتقة الوسيطة &quot;خلايا تنظيم ضربات القلب&quot; من الجهاز (GI) التي تولد موجات الهضمي بطيء العفوية المطلوبة لالتمعج والتوسط من المدخلات العصبية system1 العصبي المعوي. فرعية مختلفة من المحكمة الجنائية الدولية شكل شبكات متميزة في العضلية والجهاز الهضمي 2،3. ويرتبط فقدان أو ضرر وقع على هذه الشبكات مع عدد من اضطرابات حركية 4. المحكمة الجنائية الدولية تعبر عن الخلايا مستقبلات كيناز التيروزين KIT على غشاء البلازما وكيت وقد استخدمت immunostaining على مدى السنوات ال 15 الماضية لتسمية شبكة 5،6 المحكمة الجنائية الدولية. الأهم من ذلك ، مطلوب النشاط العادي للمحكمة الجنائية الدولية من أجل التنمية KIT 5،6. رمي تحول الخلايا نتائج المحكمة الجنائية الدولية في الورم انسجة الجهاز الهضمي (GIST) ، التي تؤوي كثيرا الطفرات KIT اكتساب وظيفة من بين 7،8. نحن أظهرت مؤخرا أن ETV1 عامل بقاء النسب المحددة التي أعرب عنها في النسب للمحكمة الجنائية الدولية / GIST والمنظم الرئيسي الترانسكربتي المطلوبة لكل من الطبيعي تشكيل شبكة من المحكمة الجنائية الدولية وتكون الأورام GIST 9. نظهر أيضا أنها تتعاون مع تفعيل الطفرات في KIT تكون الأورام. هنا ، نحن تصف أساليب التصور شبكات المحكمة الجنائية الدولية في الفئران ، ويعتمد بشكل كبير على البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا 10،11. في الآونة الأخيرة ، تم أيضا القناة كلوريد anoctamin 1 (ANO1) التي توصف بأنها علامة غشاء محددة من المحكمة الجنائية الدولية 11،12. لما لها من البلازما توطين الغشاء ، يمكن استخدام كل من البروتينات المناعي لتصور شبكات المحكمة الجنائية الدولية. هنا ، نحن تصف تصور من قبل المحكمة الجنائية الدولية الشبكات الثابتة والمجمدة cyrosections الاستعدادات لشن كله.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice at JoVE.com

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

الخلايا من خلالي كاجال (ICC) هي خلايا تنظيم ضربات القلب من الجهاز (GI) الهضمي. انهم يشكلون شبكات معقدة بين خلايا العضلات الملساء وبعد العقدية الألياف العصبية لتنظيم انقباض الجهاز الهضمي. هنا ، نقدم أساليب المناعي مستعرضة وكله يشن التصور شبكات المحكمة الجنائية الدولية الفئران.

تصور من خلايا خلالية لشبكة (ICC) في الفئران كاجال

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

تقنية التصوير السريع للخلايا الخميرة لايف مشلول

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

العد وتحديد صلاحية خلايا مثقف

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing Subculturing وخلايا الثدييات

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

تجميد والذوبان ، وخلايا تغليف للنقل

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

تصور G3BP الإجهاد حبيبات حيوية في الخلايا الأولية لايف

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...