Name: immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins
Uploaded: 2011-07-01T12:00:00
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Este estudio fue apoyado por el Servicio de Salud Pública de subvención AI-34 431 (a DAH) del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y VA Fondos de Investigación Médica (a DAH).

1. La fijación de Leptospira a las diapositivas de cristal <ol><li> Leptospira interrogans es una clase BSL2 patógeno. Trabajar con células vivas que requiere un manejo adecuado, como guantes, bata de laboratorio y medidas de pipeteo en una campana estéril. </li><li> Crecer Leptospira en EMJH medium11, complementada con suero de conejo al 1% a 30 ° C hasta llegar a mediados o finales de la fase de inicio de sesión (la densidad de 5 x 10 7 5 x 10 8 células / ml) durante aproximadam...

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	<li>Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+facets+of+bacterial+porins.">Multiple facets of bacterial porins.</a> FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).</li><li>Haake, D. A., Matsunaga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+leptospiral+outer+membrane+and+description+of+three+novel+leptospiral+membrane+proteins.">Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins.</a> Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).</li><li>Haake, D. 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La superficie de nuestra técnica de IFA es similar a la utilizada para demostrar la superficie de exposición de los diversos borrelial 15, 16 y leptospirosis 12, 17 proteínas. Los detalles de la superficie, método IFA descritos aquí están diseñados para reducir al mínimo la manipulación de células en un esfuerzo por mantener la integridad de la membrana externa de tiempo que se aprovechan de la tendencia de las células de Leptospira a adherirse a las diapositivas de cristal. El método c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Dos, así la cámara de diapositivas de vidrio </td><td> Lab-Tek </td><td> 177380 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de conejo </td><td> Rockland inmunoquímicos </td><td> D209-00-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Leptospira enriquecimiento EMJH </td><td> BD Difco </td><td> 279510 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / sondas moleculares </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / sondas moleculares </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> 4&#39;6-diamidino-2-fenil-indol dihidrocloruro (DAPI) </td><td> Invitrogen / sondas moleculares </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar Oro anti-fade medio de montaje </td><td> Invitrogen / sondas moleculares </td><td> P36930 </td><td> Alcancen la temperatura ambiente antes de su uso </td></tr><tr><td> Fisherfinest prima de vidrio cubierta </td><td> Pescador </td><td> 12-544-14 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 40 </td><td></td></tr></tbody></table>

immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins

La superficie de las proteínas bacterianas están involucradas en contacto directo con las células huésped y en la absorción de nutrientes del medio ambiente 1. Por esta razón, la localización celular puede ayudar a comprender el papel funcional de las proteínas bacterianas. Localización de la superficie de las proteínas bacterianas es un paso clave hacia la identificación de factores de virulencia que participan en los mecanismos de patogenicidad. Métodos de fraccionamiento 2.5 membranas leptospira puede ser selectiva para una cierta clase de proteínas de la membrana externa (OMP), como las lipoproteínas vs OMPs transmembrana, y por lo tanto, llevar a errores de clasificación. Esto probablemente es debido a las diferencias estructurales y la forma en que están asociados a la membrana externa. Las lipoproteínas se asocia con membranas a través de una interacción hidrofóbica entre la fracción lipídica N-terminal (tres ácidos grasos) y los fosfolípidos bicapa lipídica 6, 7. Por el contrario, OMPs transmembrana suelen estar integrados en la bicapa lipídica por anfipáticas β-hojas dispuestas en una estructura de barril-como 8, 9. Además, la presencia de una proteína en la membrana externa, no garantiza necesariamente que la proteína o sus dominios están expuestos en la superficie. Espiroquetas membranas externas se sabe que son métodos frágil y por tanto, requiere la participación manipulación suave de las células y la inclusión de proteínas de sub-superficie de control para evaluar la integridad de la membrana externa. A continuación, presentamos un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) para evaluar directamente la exposición de la superficie de las proteínas en las leptospiras intacto. Este método se basa en el reconocimiento de proteínas de la superficie de leptospiras por el antígeno de anticuerpos específicos. En esto, los anticuerpos específicos para OmpL54 10 son detetcted aftero vinculante a los nativos epítopos de la superficie, expuestos. Comparación de la reactividad de anticuerpos frente a células intactas permeabilized permite la evaluación de la distribución de celulares y si una proteína está presente en la superficie de forma selectiva leptospirosis. La integridad de la membrana externa deben ser evaluados utilizando anticuerpos contra una o más proteínas del subsuelo, preferentemente en el periplasma. El método de la superficie de la IFA se puede utilizar para analizar la exposición de la superficie de cualquier proteína de leptospira a que los anticuerpos específicos disponibles. Tanto la utilidad y las limitaciones del método depende de si los anticuerpos empleados son capaces de unirse a epítopos nativos. Dado que los anticuerpos a menudo se levantan contra las proteínas recombinantes, los epítopos de los nativos, expuestas en la superficie las proteínas no pueden ser reconocidos. Sin embargo, el método de la superficie de IFA es una herramienta valiosa para el estudio de los componentes de la superficie bacteriana intacta. Este método se puede aplicar no sólo para las leptospiras, pero también otras espiroquetas y bacterias gram-negativas. Para conclusiones más sólidas sobre la superficie de exposición de OMP, un enfoque integral que implique a varios métodos de localización celular se recomienda 10.

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Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Un método eficaz para evaluar la superficie de exposición de las proteínas de la leptospirosis se describe. El método está diseñado específicamente para evitar la interrupción de la frágil membrana externa de las células de leptospira. Esta técnica requiere el empleo de varios controles negativos para evaluar la integridad de la membrana externa y la especificidad de la reacción de los anticuerpos.

Inmunofluorescencia ensayo de leptospiras superficie expuesta proteínas

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

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