Name: immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins
Uploaded: 2011-07-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins at JoVE.com

Denna studie fick stöd av Public Health Service bevilja AI-34.431 (till DAH) från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar samt VA Medical Research fonder (till DAH).

1. Fixering av Leptospira till glas diabilder <ol><li> Leptospira interrogans är en klass BSL2 patogen. Arbeta med levande celler Den kräver lämplig hantering, såsom handskar, lab-päls och pipettera steg i en steril-huva. </li><li> Väx Leptospira i EMJH medium11, kompletterad med 1% kaninserum vid 30 ° C tills de når mitten till slutet-log fas (täthet av 5 x 10 7 till 5 x 10 8 celler / ml) i cirka 6 dagar. </li><li> Harvest kulturen genom centrifugering vid ~ 2000 xgi 7 min i ru...

<ol>
	<li>Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+facets+of+bacterial+porins.">Multiple facets of bacterial porins.</a> FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).</li><li>Haake, D. A., Matsunaga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+leptospiral+outer+membrane+and+description+of+three+novel+leptospiral+membrane+proteins.">Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins.</a> Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+surface+of+Leptospira+interrogans+serovar+grippotyphosa+during+in+vitro+cultivation.">Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation.</a> Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).</li><li>Nally, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+proteomic+analysis+of+outer+membrane+vesicles+from+a+clinical+isolate+of+Leptospira+interrogans+serovar+Copenhageni.">Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni.</a> Proteomics. 5, 144-152 (2005).</li><li>Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+outer+membrane+and+secreted+proteins+of+Leptospira+interrogans+serovar+pomona.">Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona.</a> Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).</li><li>Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+proteins+of+pathogenic+spirochetes.">Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spirochaetal+lipoproteins+and+pathogenesis.">Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis.</a> Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).</li><li>Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins:+barrels+in+a+nutshell.">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li><li>Schulz, G., Benz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The structures of general porins. , (2004).</li><li>Pinne, M., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+approach+to+identification+of+surface-exposed,+outer+membrane-spanning+proteins+of+Leptospira+interrogans.">A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans.</a> PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).</li><li>Johnson, R. C., Rogers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+leptospires.+II.+The+action+of+8-azaguanine.">Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine.</a> Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).</li><li>Cullen, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfaceome+of+Leptospira+spp.">Surfaceome of Leptospira spp.</a> Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).</li><li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+and+sequence+analysis+of+the+gene+encoding+OmpL1,+a+transmembrane+outer+membrane+protein+of+pathogenic+Leptospira+spp.">Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp.</a> J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).</li><li>Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+temporal+and+spatial+patterns+of+outer+surface+lipoprotein+expression+generate+population+heterogeneity+and+antigenic+diversity+in+the+Lyme+disease+spirochete,+Borrelia+burgdorferi.">Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).</li><li>Noppa, L., &#214;stberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergstr&#246;m, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P13+an+integral+membrane+protein+of+Borrelia+burgdorferi,+is+C-terminally+processed+and+contains+surface-exposed+domains.">P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains.</a> Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).</li><li>Parveen, N., Leong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+glycosaminoglycan-binding+adhesin+of+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi.">Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).</li><li>Ristow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence.">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).</li></ol>

Vår yta IFA Tekniken liknar den som används för att visa på ytan exponering av olika borrelial 15, 16 och leptospiral 12, 17 proteiner. Detaljerna i ytan IFA-metoden som beskrivs här är utformade för att minimera manipulation av celler i ett försök att upprätthålla yttre membran integritet samtidigt dra nytta av tendens Leptospira celler att hålla sig till objektglas. Metoden innebär en lägre koncentration (2% respektive 4%) av paraformaldehyd, tvätt med ytter-membranstabiliserande b...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (frivilligt) </th></tr><tr><td> Två väl kammare glasskivor </td><td> Lab-Tek </td><td> 177.380 </td><td></td></tr><tr><td> Kaninserum </td><td> Rockland Immunochemicals </td><td> D209-00 till 0100 </td><td></td></tr><tr><td> Leptospira Berikning EMJH </td><td> BD Difco </td><td> 279.510 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 get-anti-kanin IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / molekylära sonder </td><td> A-11.034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 get-anti-mus-IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / molekylära sonder </td><td> A-11.029 </td><td></td></tr><tr><td> 4&#39;6-diamidino-2-fenyl-indole dihydroklorid (DAPI) </td><td> Invitrogen / molekylära sonder </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Förläng Guld anti-fade monteringsmedium </td><td> Invitrogen / molekylära sonder </td><td> P36930 </td><td> Rumstemperatur före användning </td></tr><tr><td> Fisherfinest Premium skyddsglas </td><td> Fisher </td><td> 12-544-14 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescensmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 40 </td><td></td></tr></tbody></table>

immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins

Bakteriella ytproteiner är involverade i direkt kontakt med värdceller och upptag av näringsämnen från omgivningen 1. Av denna anledning kan cellulär lokalisering ge insikter i funktionella rollen för bakteriella proteiner. Yta lokalisering av bakteriella proteiner är ett viktigt steg mot identifiering av virulensfaktorer inblandade i mekanismer för patogenitet. Metoder för fraktionering leptospiral membran 2-05 maj vara selektiv för en viss klass av yttre membranproteiner (OMPs), såsom lipoproteiner vs OMPs transmembrana, och därmed leda till felaktig klassificering. Detta sannolikt beror på strukturella skillnader och hur de är knutna till det yttre membranet. Lipoproteiner är associerade med membran via en hydrofob interaktion mellan de N-terminala lipid fraktion (tre fettsyror) och lipider fosfolipider tvåskiktsmembran 6, 7. Däremot är transmembrana OMPs typiskt integrerat i membranet genom amphipathic β-ark ordnade i ett fat-liknande struktur 8, 9. Dessutom har förekomsten av ett protein i yttre membranet inte nödvändigtvis garanterar att det protein eller dess domäner exponeras på ytan. Spirochetal yttre membran är kända för att vara bräcklig och därför kräver metoder som innebär varsam manipulation av celler och integrering av underjordiska protein kontroller för att bedöma integriteten av yttre membran. Här presenterar vi ett immunofluorescenstest (IFA) för att direkt bedöma exponeringsyta av proteiner på intakt leptospira. Denna metod är baserad på erkännande av leptospiral ytproteiner av antigen-specifika antikroppar. Häri finns antikroppar specifika för OmpL54 10 detetcted aftero bindning till infödda, yta exponerad epitoper. Jämförelse av antikroppar reaktivitet på intakt kontra permeabilized celler möjliggör utvärdering av cellulära distributionen och om huruvida ett protein selektivt finns på leptospiral yta. Integriteten för yttre membran bör bedömas med hjälp av antikroppar mot en eller flera markytan proteiner, företrädesvis är belägen i periplasm. Ytan IFA Metoden kan användas för att analysera exponeringsyta någon leptospiral protein vilka specifika antikroppar är tillgängliga. Både nyttan och begränsning av metod beror på om de använda antikroppar kan binda till infödda epitoper. Eftersom antikroppar ofta riktats mot rekombinanta proteiner, epitoper av infödda, yt-exponerade proteiner kan inte identifieras. Ändå är ytan IFA-metoden ett värdefullt verktyg för att studera delar av intakt bakteriella ytor. Denna metod kan tillämpas inte bara för leptospira utan också andra spiroketer och gramnegativa bakterier. För starkare slutsatser om yt-exponering OMPs, är en övergripande strategi som omfattar flera metoder cell lokalisering rekommenderade 10.

Watch this Scientific Journal Video about Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins at JoVE.com

Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

En effektiv metod för att bedöma ytaktiva exponering leptospiral proteiner beskrivs. Metoden är särskilt utformade för att undvika störningar av den bräckliga yttre membranet av leptospiral celler. Denna teknik kräver anställning av flera negativa kontroller för att bedöma integriteten av yttre membran och specificitet antikroppsreaktion.

Immuno-fluorescens-analys av Leptospiral Surface-exponerade Proteiner

Bacterial surface proteins are involved in direct contact with host cells and in uptake of nutrients from the environment 1. For this reason, cellular ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

En TIRF Mikroskopi Teknik för Real-time, samtidig avbildning av TCR och dess associerade signalproteiner

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Plackanalys för murin Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Metodik för effektiv generering av fluorescerande märkta vacciniavirusproteiner

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Använda fluorescerande proteiner till Monitor Glycosome Dynamics i den afrikanska trypanosom

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Fag Phenomics: Fysiologiska Approaches att karaktärisera Novel virusproteiner

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Mycket känslig analys för Mätning av Arenavirus-cellvidhäftning

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Optimering av en kvantitativ Micro-neutraliseringstest

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identifiering av Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Inriktning cystein tioler för in Vitro platsspecifika Glycosylation av rekombinanta proteiner

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Rening av virus-DNA för identifiering av associerade Viral och cellulära proteiner

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...