Name: identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay
Uploaded: 2011-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay at JoVE.com

Wij danken de UMass flow cytometrie kern: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu en Tammy Krupoch. Dit werk werd gefinancierd door NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) en NIH CA T32-130807 (JRS). Core middelen gesteund door het Diabetes Endocrinologie Research Center te verlenen DK32520 werden ook gebruikt.

1. Oogsten van de weefsels <ol><li> Bereid buisjes met 2 tot 5 ml koude vlekken buffer (fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met toegevoegde 0,2% BSA en 5mm glucose). Houden buizen op ijs voorafgaand aan de weefsel oogst. </li><li> Cull muizen volgens passende goedgekeurde protocol (bv CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie). </li><li> Trekken bloed door het hart doorboren in EDTA of heparine bloed-collectie buizen voor latere analyse, bijvoorbeeld van de hematocriet, aantal reticulocyten of CB...

<ol>
	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

De flow-cytometrische methodiek maakt gelijktijdig onderzoek van alle cellulaire functie die kunnen worden gedetecteerd met een fluorescentie-geconjugeerd specifiek antilichaam of ligand, waaronder celoppervlaktemerkers, eiwitexpressie, overleving van de cel signaleren met behulp van fosfo-specifieke antilichamen 3 en celcyclus status. Deze metingen kunnen worden gedaan in elk van een aantal van de differentiatie-fase specifieke subgroepen, in het kader van vers geïsoleerde erytropoëtische weefsel. Deze met...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Fas-biotine </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Streptavidine-APC </td><td> Molecular Probes </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 micrometer steriele cel zeef </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Polystyreen ronde bodem buizen voor FACS kleuring </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> U-bodem 96 wells plaat </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure Rabbit IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (voorraad 0.5mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> Ter119-PE (voorraad 0.2mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD-Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI poeder </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-muis-CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G en Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU Flow kit </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Annexine V-biotine </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

De studie van de erytropoëse wil om te begrijpen hoe rode cellen worden gevormd uit eerdere hematopoëtische en erythroid voorlopers. In het bijzonder, is de snelheid van de rode bloedcellen de vorming gereguleerd door het hormoon erytropoëtine (EPO), waarvan de synthese wordt geactiveerd door weefselhypoxie. Een bedreiging voor een adequate zuurstofvoorziening van de weefsels resulteert in een snelle toename van EPO, het rijden een verhoging van de erytropoëtische tarief, een proces dat bekend staat als de erytropoëtische stress respons. De daaruit voortvloeiende toename van het aantal circulerende rode bloedcellen verbetert weefsel zuurstof levering. Een efficiënte erytropoëtische reactie op stress is dan ook van cruciaal belang voor het overleven en herstel van fysiologische en pathologische omstandigheden, zoals grote hoogte, bloedarmoede, bloedingen, chemotherapie of stamceltransplantatie. De muis is een belangrijke model voor de studie van de erytropoëse en de reactie op stress. Muis definitieve (volwassen-type) erytropoëse vindt plaats in de foetale lever tussen embryonale dag 12,5 en 15,5, in de neonatale milt, en bij volwassen milt en beenmerg. Klassieke methoden voor het identificeren erytroïde voorlopercellen in het weefsel vertrouwen op het vermogen van deze cellen om aanleiding te geven tot rode bloedcellen kolonies toen bedekt met Epo-bevattende semi-vaste media. Hun erytroïde voorloper nakomelingen zijn geïdentificeerd op basis van morfologische criteria. Geen van deze klassieke methoden toegang tot een groot aantal van differentiatie-fase-specifieke erythroïde cellen voor moleculair onderzoek. Hier presenteren wij een flow-cytometrische methode voor het identificeren en bestuderen van differentiatie-fase-specifieke erytroïde voorlopers en voorlopers, direct in de context van vers geïsoleerde muis weefsel. De test is gebaseerd op het celoppervlak markers CD71, Ter119, en op de flow-cytometrische &#39;forward-scatter&#39; parameter, die een functie is van de celgrootte. De CD71/Ter119 assay kan worden gebruikt om erythroïde voorouders bestuderen tijdens hun reactie op erytropoëtine stress in vivo, bijvoorbeeld bij anemische muizen of muizen ondergebracht in lage zuurstofgehalte. Het kan ook worden gebruikt om erythroïde voorouders studie direct in de weefsels van genetisch gemodificeerde volwassen muizen of embryo&#39;s, om de specifieke rol van de gewijzigde moleculaire route in erytropoëse te beoordelen.

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay at JoVE.com

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Een flow-cytometrische methode voor de identificatie en moleculaire analyse van differentiatie-fase-specifieke muriene erytroïde voorlopers en precursoren, direct in vers geoogste muis beenmerg, milt of foetale lever. De test is gebaseerd op het celoppervlak markers CD71, Ter119, en de celgrootte.

Identificatie en analyse van de muis erytroïde voorouders met behulp van de CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Zuivering van voorlopercellen uit Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Een kwantitatieve test voor insuline-expressie Kolonie-vormende voorouders

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Cytometrische analyse van extracellulaire blaasjes van cel-geconditioneerd Media stromen

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Identificatie, isolatie en karakterisering van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopercellen (MP's) in skeletspieren bij de rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Een geïntegreerde aanpak voor microproteïne-identificatie en sequentieanalyse

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...

Quantitative Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic Î²-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches (Video) | JoVE

Complementaire benaderingen om mitofagieflux in pancreas-β-cellen te ondervragen

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...