Name: identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay
Uploaded: 2011-08-05T13:00:00
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Wir danken der UMass Durchflusszytometrie Kern: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu und Tammy Krupoch. Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) und NIH CA T32-130807 (JRS) finanziert. Core-Ressourcen durch die Diabetes Endocrinology Research Center gewähren DK32520 unterstützt wurden ebenfalls verwendet.

1. Harvesting von Geweben <ol><li> Bereiten Röhrchen mit 2 bis 5 ml kaltem Färbepuffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Zusatz von 0,2% BSA und 5 mM Glucose). Keep Röhrchen auf Eis vor der Gewebe zu ernten. </li><li> Cull Mäusen nach geeigneten genehmigten Protokoll (z. B. CO 2-Inhalation durch Genickbruch folgte). </li><li> Draw Blut durch Herzpunktion in EDTA-oder Heparin-Blut-Sammlung Rohre für eine spätere Analyse, z. B. von Hämatokrit, Retikulozyten oder CBC-Analyse. </li><li> Ernt...

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	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

Die durchflusszytometrische Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung aller zellulären Funktion, die mit einem Fluoreszenz-konjugierte spezifische Antikörper oder Liganden, einschließlich Zelloberflächenmarker, Proteinexpression, das Überleben der Zelle, Zell-Signal mit Hilfe phospho-spezifische Antikörper 3 und Zellzyklus-Status nachgewiesen werden kann. Diese Messungen können in jedem der eine Reihe von Differenzierungs-Bühne spezifische Teilmengen erfolgen, die im Rahmen von frisch isolier...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Fas-Biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Streptavidin-APC </td><td> Molecular Probes </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 um sterile Zellsieb </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Polystyrol Rundboden-Röhrchen für FACS-Färbung </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> U-Boden 96-Well-Platte </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure Rabbit IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (stock 0,5-Promillegrenze) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> TER119-PE (stock 0.2mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD-Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI Pulver </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Maus-CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Maus-Ly-6G und Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU Flow Kit </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Annexin V-Biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

Das Studium der Erythropoese möchte verstehen, wie rote Blutkörperchen sind aus früheren hämatopoetischen Vorläuferzellen und erythroiden gebildet. Genauer gesagt, ist die Rate der roten Blutkörperchen Bildung durch das Hormon Erythropoietin (Epo), dessen Synthese durch Hypoxie ausgelöst geregelt. Eine Bedrohung für die ausreichende Sauerstoffversorgung des Gewebes führt zu einem raschen Anstieg der Epo, Fahren eine Erhöhung der Erythropoese-Rate, ein Verfahren, wie der erythropoetischen Stress-Reaktion bekannt. Der daraus resultierende Anstieg der Zahl der zirkulierenden roten Blutkörperchen verbessert Gewebe Sauerstoffzufuhr. Eine effiziente erythropoetischen Stress-Reaktion ist daher entscheidend für das Überleben und die Wiederherstellung von physiologischen und pathologischen Bedingungen wie Höhenlage, Anämie, Blutungen, Chemotherapie oder Stammzelltransplantation. Die Maus ist ein Schlüssel-Modell für das Studium der Erythropoese und ihre Reaktion auf Stress. Maus definitive (Erwachsenen-Typ) Erythropoese findet in der fetalen Leber zwischen embryonalen Tage 12.5 und 15.5, in der Neugeborenen-Milz und in der Erwachsenenbildung Milz und Knochenmark. Klassische Methoden zur Identifizierung erythroiden Vorläuferzellen im Gewebe verlassen sich auf die Fähigkeit dieser Zellen zu steigen, um red cell Kolonien geben, wenn in Epo-haltigen halbfesten ausplattiert. Ihre erythroiden Vorläuferzellen Nachkommen werden auf der Basis morphologischer Kriterien identifiziert. Keiner von diesen klassischen Methoden erlauben den Zugriff auf eine große Anzahl von Differenzierungs-Stadium-spezifischen erythroiden Zellen für die molekulare Untersuchung. Hier präsentieren wir Ihnen eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und Differenzierung Studium-stage-spezifischen erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt im Zusammenhang mit der frisch isolierten Maus Gewebe. Der Test beruht auf der Zell-Oberflächenmarker CD71, TER119, und auf der durchflusszytometrischen &#39;forward-scatter&#39; Parameter ist das eine Funktion der Größe der Zellen. Die CD71/Ter119 Assay verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen während ihrer Antwort auf erythropoetischen Stress in vivo-Studie werden zum Beispiel bei anämischen Mäusen oder Mäusen in sauerstoffarmen Bedingungen untergebracht. Es kann auch verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen direkt in das Gewebe von genetisch veränderten adulten Mäusen oder Embryonen zu studieren, um die spezifische Rolle der modifizierten molekularen Signalweg in Erythropoese zu beurteilen.

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Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und molekulare Analyse von Differenzierungs-Stadium-spezifische murine erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt in frisch geernteten Maus Knochenmark, Milz oder fetale Leber. Der Test beruht auf der Zelloberfläche Marker CD71, TER119 und Zellgröße.

Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) in der Skelettmuskulatur der Ratte

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Ein integrierter Ansatz zur Identifizierung und Sequenzanalyse von Mikroproteinen

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...

Quantitative Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic Î²-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches (Video) | JoVE

Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...