Name: identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay
Uploaded: 2011-08-05T13:00:00
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Damos las gracias a la base de citometría de flujo la Universidad de Massachusetts: Richard Konz, Giehl Ted, Gosselin Barbara, Gu Yuehua y Krupoch Tammy. Este trabajo fue financiado por NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) y NIH CA T32-130 807 (JRS). Los recursos básicos con el apoyo de la Diabetes Endocrinología del Centro de Investigación de subvención DK32520 también fueron utilizados.

1. La recolección de los tejidos <ol><li> Prepare los tubos que contienen 2 a 5 ml de tampón de tinción de frío (tampón fosfato salino (PBS) con adición de 0,2% de BSA y glucosa 5 mM). Mantenga los tubos en hielo antes de la cosecha de tejidos. </li><li> Ratones sacrificio acuerdo con el protocolo adecuado aprobado (por ejemplo, CO 2 por inhalación seguido por dislocación cervical). </li><li> Extracción de sangre por punción cardiaca en tubos con EDTA o heparina de recogida de sangre para su poste...

<ol>
	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

La metodología de citometría de flujo permite la investigación simultánea de cualquier función celular que puede ser detectada con un anticuerpo específico conjugado con fluorescencia o ligando, incluidos los marcadores de superficie celular, expresión de la proteína, la supervivencia celular, la señalización celular utilizando fosfato anticuerpos específicos 3 y el estado del ciclo celular. Estas mediciones se pueden hacer en cada uno de una serie de subgrupos específicos de la etapa de diferenci...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Fas-biotina </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Estreptavidina-APC </td><td> Las sondas moleculares </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 micras filtro de células estériles </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Poliestireno de fondo redondo de tubos para la tinción FACS </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> De fondo en U placa de 96 pocillos </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure conejo IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) </td><td> BD Biosciences- </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) </td><td> BD Biosciences- </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD Biosciences- </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI en polvo </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC rata anti-CD41 de ratón MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC rata anti-ratón CD45R/B220 RA3-6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC rata anti-ratón CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> Rata FITC anti-ratón Ly-6G y Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> Hamster FITC anti-ratón CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU flujo kit </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Anexina V-biotina </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

El estudio de la eritropoyesis tiene como objetivo entender cómo las células rojas se forman a partir de progenitores hematopoyéticos y antes eritroides. En concreto, la tasa de formación de glóbulos rojos está regulada por la hormona eritropoyetina (EPO), cuya síntesis es provocada por la hipoxia tisular. Una amenaza para la adecuada oxigenación a los tejidos en los resultados de un rápido aumento de la EPO, impulsando un aumento en la tasa de eritropoyesis, un proceso conocido como la respuesta al estrés eritropoyética. El aumento resultante en el número de glóbulos rojos mejora la entrega de oxígeno tisular. Una respuesta eficaz estrés eritropoyética tanto, es fundamental para la supervivencia y la recuperación de las condiciones fisiológicas y patológicas como la altitud, anemia, hemorragia, la quimioterapia o trasplante de células madre. El ratón es un modelo clave para el estudio de la eritropoyesis y su respuesta al estrés. Eritropoyesis definitiva del ratón (tipo adulto) se lleva a cabo en el hígado fetal entre los días embrionarias 12,5 y 15,5, en el bazo neonatal, y en el bazo y la médula ósea adulta. Los métodos clásicos de identificación de los progenitores eritroides en el tejido de confiar en la capacidad de estas células para dar lugar a colonias de glóbulos rojos cuando se siembran en la EPO que contienen medio semi-sólido. Su progenie precursores eritroides se identifican con base en criterios morfológicos. Ninguno de estos métodos clásicos permiten el acceso a un gran número de diferenciación de etapas específicas de las células eritroides para el estudio molecular. Aquí presentamos un método de citometría de flujo de identificación y estudio de la diferenciación etapa específica de los progenitores eritroides y precursores, directamente en el contexto de tejido de ratón recién aisladas. El ensayo se basa en los marcadores de superficie celular CD71, Ter119, y en la citometría de flujo parámetro &quot;dispersión frontal, que es una función del tamaño de la celda. El ensayo CD71/Ter119 puede ser usado para estudiar los progenitores eritroides en su respuesta al estrés eritropoyética en vivo, por ejemplo, en ratones con anemia o ratones alojados en condiciones de poco oxígeno. También puede ser utilizado para estudiar los progenitores eritroides directamente en los tejidos de ratones adultos o de embriones genéticamente modificados, a fin de evaluar la función específica de la vía de modificación molecular de la eritropoyesis.

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Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Un método de citometría de flujo para la identificación y el análisis molecular de la diferenciación de etapas específicas de murino progenitores eritroides y precursores, directamente en la médula ósea recién cosechadas del ratón, el bazo o el hígado fetal. El ensayo se basa en los marcadores de superficie celular CD71, Ter119 y tamaño de la celda.

Identificación y análisis de los progenitores eritroides ratón usando el CD71/TER119 citometría de flujo ensayo

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

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Biology

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Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Identificación, aislamiento y caracterización de progenitores fibroadipogénicos (FAP) y progenitores miogénicos (MP) en el músculo esquelético en la rata

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

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Un enfoque integrado para la identificación de microproteínas y el análisis de secuencias

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Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic Î²-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches (Video) | JoVE

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