Name: identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay
Uploaded: 2011-08-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay at JoVE.com

Vi tackar UMass kärnan flödescytometri: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu och Tammy Krupoch. Detta arbete har finansierats av NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) och NIH CA T32-130.807 (JRS). Kärna resurser som stöds av Diabetes Endokrinologi Research Center bevilja DK32520 användes också.

1. Skörd av vävnader <ol><li> Förbered rör som innehåller 2 till 5 ml kall färgning buffert (fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med tillsats av 0,2% BSA och 5mm glukos). Håll rören på is innan vävnad skörd. </li><li> Cull möss enligt lämpliga godkänt protokoll (t.ex. CO 2 inandning följt av halsdislokation). </li><li> Dra blod från hjärtat till EDTA eller heparin blod-kollektionen rör för senare analys, t.ex. av hematokrit, retikulocyter eller CBC analys. </li><li> Harvest mjälten och ben,...

<ol>
	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

Flödet-cytometrisk metoden tillåter samtidig undersökning av cellfunktioner som kan upptäckas med en fluorescens-konjugerad antikropp eller ligand, inklusive markörer cellytan, protein uttryck, cellöverlevnad, cellsignalering med fosfor-specifika antikroppar 3 och cellcykeln status. Dessa mätningar kan göras i varje ett antal differentiering steg specifika undergrupper, i samband med nyligen isolerade erytropoetisk vävnad. Denna metod gör därför bedömningen av funktionella och molekylära förän...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th></tr><tr><td> Fas-biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554.256 </td></tr><tr><td> Streptavidin-APC </td><td> Molekylära sonder </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 ìm steril cell sil </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Polystyren rundbottnad rör för FACS färgning </td><td> BD Falcon </td><td> 352.008 </td></tr><tr><td> U-botten 96 brunnar </td><td> BD Falcon </td><td> 353.910 </td></tr><tr><td> ChromePure Kanin IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (lager 0.5mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553.266 </td></tr><tr><td> Ter119-PE (lager 0.2mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553.673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD-Biosciences </td><td> 559.925 </td></tr><tr><td> DAPI pulver </td><td> Roche </td><td> 236.276 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-mus-CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553.848 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-mus CD45R/B220 RA3-6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553.087 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-mus CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557.396 </td></tr><tr><td> FITC Rat anti-mus-Ly-6G och Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553.126 </td></tr><tr><td> FITC Hamster anti-mus CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553.061 </td></tr><tr><td> APC BrdU Flow kit </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557.892 </td></tr><tr><td> Annexin V-biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556.418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

Studien av erytropoes syftar till att förstå hur röda blodkroppar bildas från tidigare hematopoetisk och erytroida stamceller. Specifikt är graden av röda blodkroppar bildas regleras av hormonet erytropoietin (EPO), vars syntes utlöses av hypoxi. Ett hot mot tillfredsställande resultat vävnad syresättning i en snabb ökning av Epo, köra en ökning erytropoetiska takt, en process som kallas erytropoetiska stress. Den resulterande ökningen av antalet cirkulerande röda blodkroppar förbättrar leveransen vävnad syre. En effektiv erytropoetisk stress är därför avgörande för överlevnad och återhämtning från fysiologiska och patologiska förhållanden såsom hög höjd, anemi, blödning, kemoterapi eller stamcellstransplantation. Musen är en viktig modell för studiet av erytropoes och stress. Mus definitiva (vuxen-typ) erytropoes sker i fostrets lever mellan embryonala dagar 12,5 och 15,5, i neonatal mjälten, och hos vuxna mjälte och benmärg. Klassiska metoder för att identifiera erytroida stamceller i vävnad är beroende av förmågan hos dessa celler ger upphov till röda blodkroppar kolonier när pläterade i Epo innehåller halvfast media. Deras erytroida föregångare avkomma identifieras baseras på morfologiska kriterier. Ingen av dessa klassiska metoder ger tillgång till ett stort antal differentiering-stegs-specifika erytroida celler för molekylär studie. Här presenterar vi ett flöde-cytometrisk metod för att identifiera och studera differentiering-stegs-specifika erytroida progenitorer och prekursorer, direkt i samband med nyligen isolerade mus vävnad. Analysen bygger på cellytan markörer CD71, Ter119 och på flöde-cytometrisk &quot;framåt-scatter&quot; parameter, som är en funktion av cellens storlek. Den CD71/Ter119 analysen kan användas för att studera erytroida stamceller under sin reaktion på erytropoietiskt stressen in vivo, till exempel i anemic möss och möss inrymda i låga syreförhållanden. Det kan också användas för att studera erytroida stamceller direkt i vävnaderna av genetiskt modifierade vuxna möss eller embryon, för att bedöma den särskilda roll som den modifierade molekylärnivån i erytropoes.

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay at JoVE.com

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Ett flöde-cytometrisk metod för identifiering och molekylär analys av differentiering-stegs-specifika murin erytroida progenitorer och prekursorer, direkt i nyskördade mus benmärg, mjälte eller lever hos foster. Analysen bygger på cellytan markörer CD71, Ter119 och cellstorlek.

Kartläggning och analys av mus erytroida stamceller med CD71/TER119 Flow-cytometrisk analys

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Rening av stamceller från skelettmuskulatur

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

En kvantitativ analys av insulin som uttrycker kolonibildande stamfäder

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flödescytometrianalyser av Bimolecular Fluorescens Komplettering: En hög genomströmning kvantitativ metod för att studera protein-protein interaktion

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

SA-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

SA-β-Galaktosidasbaserad screening analys för identifiering av Senoterapeutiska läkemedel

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow flödescytometrisk analys av extracellulära blåsor från Cell-villkorade Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Identifiering, isolering och karakterisering av fibroadiogena stamceller (FAPs) och myogena stamceller (MPs) i skelettmuskulaturen i råttan

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Isolering av mus megakaryocyt progenitorer

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

En integrerad metod för mikroproteinidentifiering och sekvensanalys

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...

Quantitative Analysis of Mitophagy in Murine Pancreatic &#946;-Cells

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Assessment of Mitophagy Flux in Pancreatic Î²-Cells Using Effective and Robust Complementary Approaches (Video) | JoVE

Kompletterande metoder för att undersöka mitofagiskt flöde i bukspottkörtelns β-celler

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...