Name: detection of nitric oxide and superoxide radical anion by electron paramagnetic resonance spectroscopy from cells using spin traps
Uploaded: 2012-08-18T14:00:00
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この作品は、NIHの国立心臓、肺、血液研究所の助成金RO1 HL81248によって資金を供給された。

1。ウシ大動脈内皮細胞（BAEC）の培養<ol><li>適切な無菌テクニックが続いていた。 </li><li> 37抗生物質なしで水浴、暖かい培地℃で</li></ol> 注：培地は4.5 g / LのD-グルコースとフェノールフリーダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で構成されており、10％ウシ胎児血清（FBS）および2.5を添加した4 mM L-グルタミン、1％非必須アミノ酸、 mg / Lの内皮細胞増殖因子。 <...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconciling+the+chemistry+and+biology+of+reactive+oxygen+species.">Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).</li><li>Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol+chemistry+and+specificity+in+redox+signaling.">Thiol chemistry and specificity in redox signaling.</a> Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).</li><li>Clerch, L. B., Massaro, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. , (1997).</li><li>Gutteridge, J. M. 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Commun. , 1793-1794 (1994).</li><li>Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide:+Evaluation+of+the+spin+trapping+properties.">2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: Evaluation of the spin trapping properties.</a> Free Radical. Biol. Med. 28, 403-408 (2000).</li><li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+trapping+and+spin+adduct+decay+of+5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+(BocMPO):+kinetics+and+theoretical+analysis.">Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).</li><li>Tsuchiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide-forming+reactions+of+the+water-soluble+nitric+oxide+spin-trapping+agent,+MGD.">Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD.</a> Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).</li><li>Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+iron-dithiocarbamates+ensure+detection+of+nitric+oxide+in+cells+and+tissues.">Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues.</a> Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).</li><li>RojasWahl, R. 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Chem. 264, 12299-12302 (1989).</li><li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide:+A+new+efficient+phosphorylated+nitrone+for+the+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals.">5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).</li><li>Snyrychova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+sensitivity+of+EPR+spin+trapping+in+biological+systems+by+cyclodextrins:+A+model+study+with+thylakoids+and+photosystem+II+particles.">Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles.</a> Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).</li><li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+beta-cyclodextrin+cyclic-nitrone+conjugate:+Synthesis+and+spin+trapping+studies.">Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies.</a> J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).</li><li>Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+spin+trapping+properties+by+beta-cyclodextrin-cyclic+nitrone+conjugate.">Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate.</a> J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).</li><li>Hardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization,+and+decay+kinetics+of+ROS+and+thiyl+adducts+of+mito-DEPMPO+spin+trap.">Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap.</a> Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).</li><li>Kim, S. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+reactivity+of+a+cyclic+nitrone-calix[4]pyrrole+conjugate+with+superoxide+radical+anion:+Theoretical+and+experimental+studies.">Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).</li></ol>

EPRスピントラップは、フリーラジカルを定量化し、識別するための生物医学アプリケーションの広い範囲で採用されている。スピントラッピングは、nMからこのように生物系のアプリケーションに適していμMの範囲の濃度でラジカルを検出することができる、非常に敏感である。常磁性の付加物の形成、NO-のFe 2 +-MGDは、EPR を経由して NOの検出の基礎となっています。のFe 2...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>フェノールフリーDMEM培地 高グルコース1X </td><td> GIBCO </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP379-100 </td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸</td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11550 </td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖因子</td><td>ミリポア</td><td> 02から102 </td><td></td></tr><tr><td> CAI </td><td>エンツォ生命科学</td><td> A-23187 </td><td> DMSOに溶解</td></tr><tr><td> SIN-1 </td><td>エンツォ生命科学</td><td> BML-CN245-0020 </td><td></td></tr><tr><td> DMPO </td><td>同仁化学研究所</td><td> D048-10 </td><td></td></tr><tr><td>のFeSO 4·7H 2 O </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 215422-250G </td><td> CaとMgを含むPBSに溶解し</td></tr><tr><td> MGD </td><td>エンツォ生命科学</td><td> ALX-400-014-M050 </td><td>のCa 2 +およびMg 2を含むPBSに溶解+ </td></tr><tr><td> BAEC細胞</td><td>セルシステム</td><td> 2B2-C75 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP231-100 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td>のCaCl 2とMgCl 2とDPBS </td><td>シグマldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td>ホルボールミリステートアセテート（PMA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 79346-1mgの</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of nitric oxide and superoxide radical anion by electron paramagnetic resonance spectroscopy from cells using spin traps

低濃度で反応性窒素/酸素種（ROS / RNS）は、シグナル伝達、細胞機能の調節に重要な役割を果たしていると、免疫応答が無秩序な濃度で細胞生存率を1、2に有害である。生きているシステムでは、ROSの生成を調節する内因性および栄養抗酸化防御機構と進化してきた一方で、ROSは、酸素の正常な代謝の副産物自然に連続的に製造されており、タンパク質の機能の喪失、DNAの切断、または脂質に生じる生体分子への酸化的損傷を引き起こす可能性があります過3、最終的に細胞傷害または死亡を4につながる酸化ストレスに。 スーパーオキシドアニオンラジカル（O 2• - ）は、ペルオキシナイトライトとヒドロキシルラジカルのような生物学的システムに存在することが知られている最も高度な酸化種のいくつかの主要な前駆体である。 O 2の生成• -私は、したがって、酸化的バーストの最初の兆候を通知し、TSの検出および/または生物学的システムの隔離が重要である。このデモでは、O 2• -多形核好中球（多形核白血球）から生成されました。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）オキシダーゼ5の活性化を介して-ホルボール-12 -ミリステート-13 -アセテート（PMA）と走化性刺激により、PMN。•O 2を生成します 。 3つのアイソフォームで提供一酸化窒素（NO）合成酵素は、誘導-、神経と血管内皮-NOS、またはiNOSの、nNOSのか、eNOSのは、それぞれ、番号6を生成しないようにNADPHを用いて、L-シトルリンにL-アルギニンの変換を触媒として。ここでは、内皮細胞からNOを生成しません。酸化的ストレス条件下で、例えばeNOSのは•O 2、NOを生産に切り替えることができます-ヘム7または補助因子の酸化によって引き起こされると考えられている脱共役と呼ばれるプロセスで、テトラヒドロビオプテリン（BH 4）8。 少数がありますしかし、生体系におけるフリーラジカルの検出のための信頼できる方法は特異性と感度によって制限されます。スピントラッピングは、一般的にフリーラジカルの同定に使用され、電子常磁性共鳴（EPR）分光法によって検出することができる永続的なスピン付加物を形成するスピントラップへのラジカルの付加反応を伴うされています。様々なラジカル付加物は、生成されるラジカルを識別し、ラジカルの産生9の性質と動態に関する豊富な情報を提供することができます使用することができる独特のスペクトルを示す。 環状ニトロン、5,5 -ジメチル-ピロリン-N-オキシド、DMPO 10、ホスホリル置換されDEPMPO 11、エステル置換EMPO 12 BMPO 13は 、広くスピントラップとして採用されている-後者のスピン付加-トラップは、O 2•のために長い半減期を示す。鉄（II）-N-メチル-D-グルカミンジチオカルバミン酸のFe（MGD）2 &lt;/ SUB&gt;は、一般的に付加体形成とスピン付加物14の高安定度の高い率のためにNOを捕捉するために使用されていません。

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Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

電子常磁性共鳴（EPR）分光法はウシ大動脈内皮細胞および鉄（II）-N-メチル-D-グルカミンジチオ、Feを（MGD）を用いてヒト好中球からのスーパーオキシドラジカルアニオンから一酸化窒素を検出するために採用した<sub&gt; 2</sub&gt;と、それぞれ5,5 - ジメチル-1 - pyroroline-N-オキシド、DMPO、。

一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

C2C12筋芽細胞を用いた生体エネルギープロファイル実験

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

核磁気共鳴分光法を用いた環境メタボロミクスのための低密度プランクトンコミュニティからの代謝物の濃度

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

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細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

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無傷の動脈の内皮層における一酸化窒素とスーパーオキシドのエン顔検出

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

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の開発と特性評価<em&gt;インビトロ</em&gt;微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt;私</sub&gt;と一酸化窒素の生産

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

高感度免疫組織化学を使用してシトシンの修飾された形態の検出

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

化学発光法を用いて、生物学的材料に、一酸化窒素経路に亜硝酸塩と硝酸塩、代謝物を測定します

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...