Name: quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry
Uploaded: 2011-07-31T14:00:00
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इस काम NCI नैदानिक ​​प्रोटिओमिक प्रौद्योगिकी आकलन केंद्र (CPTAC) अनुदान (# CA126476 U24) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मनोरंजन उद्योग (EIF) फाउंडेशन और EIF महिला के कैंसर रिसर्च फंड से स्तन कैंसर biomarker खोज कंसोर्टियम के लिए एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और उबकना फाउंडेशन, कैनरी फाउंडेशन, और पॉल एलन जी परिवार फाउंडेशन से उदार उपहार.

प्रायोगिक प्रक्रिया: परख सिंथेटिक पेप्टाइड्स और विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी की आवश्यकता है. चयनित पेप्टाइड्स ब्याज की प्रोटीन के लिए अद्वितीय हो सकता है, के बीच 8 और 22 एमिनो एसिड होते हैं चाहिए, और कोई ज्ञात बाद translational संशोधनों है. Methionine अवशेषों को आम तौर पर परहेज कर रहे हैं और dibasic अमीनो एसिड (जैसे के.के., के.आर., आरआर) से युक्त पेप्टाइड्स अवांछनीय हैं. इस तकनीक के लिए, यह आम है आंतरिक मानकों के रूप में स्थिर आइसोटोप लेबल पेप्टाइड्स का उपयोग, भारी शामिल (13 सी और एन 15) अमीनो एसिड पेप्टाइड (लेबल यानी कश्मीर या अनुसंधान) सी टर्मिनस पर लेबल. निम्नलिखित एक माउस प्रोटीन osteopontin से पेप्टाइड GDSLAYGLR उपाय, Epitomics (Burlingame, CA) इंक और न्यू इंग्लैंड पेप्टाइड (गार्डनर, एमए) से सिंथेटिक पेप्टाइड्स से प्राप्त विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी का उपयोग कर विकसित परख प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. 1) के trypsin पाचन जटिल प्रोटीन मिश्रण, 2) 3 पेप्टाइड्स के संवर्धन) मास स्पेक्ट्रोमेट्री से विश्लेषण: प्रोटोकॉल तीन मुख्य चरणों (चित्रा 1) के होते हैं. यह एक मानव प्लाज्मा माउस osteopontin प्रोटीन के साथ बालीदार नमूना पर प्रदर्शन किया जाएगा. 1. Trypsin enzymatic पाचन और सफाई <ol><li> 10 μL गीला बर्फ पर स्वच्छ प्लाज्मा विभाज्य पहले गला लें. </li><li> बीसीए परख द्वारा कुल प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण और नमूना अपकेंद्रित्र के लिए किसी भी निलंबित ठोस हटाने. </li><li> Pipet इसके भंडारण ट्यूब से 10 एक 1000 μL deepwell थाली और पियर्स में सक्षम फिल्म के साथ कवर μL विभाज्य. </li><li> प्रत्येक नमूने के ताजा यूरिया / 30mm (डीटीटी) dithiothreitol (अंतिम एकाग्रता 6M डीटीटी / यूरिया 20mm) 9M 20 μL जोड़ें. </li><li> 37 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस </li><li> प्रत्येक नमूने के ताजा 500 मिमी iodoacetamide (अंतिम IAM 50mm) के 3 μL जोड़ें. </li><li> कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते हैं. </li><li> 100 मिमी (8 पीएच) Tris (dilutes 0.6M ~ यूरिया) के 257 μL जोड़ें. </li><li> Trypsin शेयर समाधान (: सब्सट्रेट अनुपात 1:50 एंजाइम के लिए 1 μg / μL) के 10 μL जोड़ें. </li><li> 37 सेते ° C रातोंरात (12-16 घंटे). </li><li> साफ चींटी एसिड (1% की अंतिम एकाग्रता) के 3 μL जोड़ें. </li><li> स्थिर आइसोटोप मानक (एकाधिक मानकों जोड़ रहे हैं अगर एक मल्टिप्लेक्स परख प्रदर्शन, आमतौर पर यह 10 μL युक्त मानक isotopically लेबल पेप्टाइड का 50-100 fmol के बारे में है) में जोड़ें. </li><li> ओएसिस कारतूस प्लेट अच्छी तरह से धो 80% acetonitrile, प्रवाह के माध्यम से discarding में 500 0.1% चींटी एसिड की μL के साथ. इस 3 बार दोहराएँ. </li><li> पानी में 0.1% चींटी एसिड के 500 μL जोड़कर कारतूस थाली संतुलित करना, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें. इस 4 बार दोहराएँ. </li><li> कारतूस थाली को पचाने नमूने लोड और वैक्यूम समायोजित इतना प्रवाह बहुत धीमी गति से है. </li><li> पानी में 0.1% चींटी एसिड के 500 μL के साथ धो, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें. इस 3 बार दोहराएँ. </li><li> 1000 μl गहरे अच्छी तरह से थाली में 80% acetonitrile में 0.1% चींटी एसिड के 2 x 500 μL जोड़कर Elute पेप्टाइड्स (प्रवाह के माध्यम से अलग नहीं है). </li><li> (या speedvac) सूखापन eluate Lyophilize. (Lyophilization पसंदीदा तरीका है) </li><li> Reconstitute 50 μL पीबीएस + 0.03% chaps जोड़कर पेप्टाइड्स सूख गया. </li></ol> 2. पेप्टाइड immunoaffinity संवर्धन <ol><li> मानक किंगफिशर 96 प्लेटें अच्छी तरह से करने के लिए नमूना हस्तांतरण. </li><li> 1 μg एंटीबॉडी और 1.5 μL लक्ष्य के प्रति प्रोटीन जी लेपित चुंबकीय मोतियों (यह वैकल्पिक है मोती के लिए एंटीबॉडी अलावा पूर्व crosslink) जोड़ें. सुनिश्चित मनकों को अच्छी तरह से मिलाते या vortexing द्वारा निलंबित कर रहे हैं. </li><li> कवर पन्नी के साथ थाली. </li><li> रातोंरात कोमल सुनिश्चित मोती निलंबित कर रहे हैं tumbling के साथ (12-16 घंटे) सेते हैं. </li><li> अपकेंद्रित्र 5 सेकंड के लिए 32 XG पर थाली पन्नी सतह से कोई भी तरल निकालने. </li><li> पन्नी कवर निकालें. </li><li> और मोतियों की धुलाई elution मैन्युअल रूप से या एक स्वचालित फैशन में किया जा सकता है. यह प्रक्रिया एक किंगफिशर मंच पर स्वचालित कदम का वर्णन करता है. </li><li> मोती 200 μL पीबीएस + 0.03% chaps (धो प्रति 1 मिनट) के साथ 2 बार धो लें. </li><li> मोती 200 पीबीएस की μL 1:10 कमजोर पड़ने + 0.03% chaps (1 मिनट) के साथ 1 बार धोएं. </li><li> पेप्टाइड्स 5% एसिटिक एसिड + 0.03% chaps के 25 उल में eluted कर रहे हैं. </li><li> एक चुंबक पर elution थाली प्लेस और एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए eluate हस्तांतरण, ध्यान लेने के बचे हुए मोती स्थानांतरण नहीं. </li><li> कवर एक सील चटाई के साथ थाली. </li><li> eluate युक्त थाली ट्रिपल विश्लेषण के लिए quadrapole मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए दिया है. </li></ol> 3. एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी द्वारा विश्लेषण - मास स्पेक्ट्रोमेट्री <ol><li> SRM / MRM विश्लेषण के लिए संक्रमण और चयनित किया जा सकता है / μL मिनट पर 0.5 मास स्पेक्ट्रोमीटर में 30% acetonitrile/0.1% चींटी एसिड पेप्टाइड मानक के microliter समाधान के प्रति एक 1 picomole infusing द्वारा अनुकूलित. एक बार स्थिर स्प्रे प्राप्त है, एक एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम इकट्ठा. </li><li> संक्रमण एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम से thre की पहचान के द्वारा चयनित हैंई थोड़ा शोर के साथ स्पेक्ट्रम के क्षेत्र में प्रचुर मात्रा में टुकड़ा आयनों. गुणा चार्ज पेप्टाइड आयनों के लिए m / y-आयन टुकड़े पाया z&gt; अग्रदूत मी / z आम तौर पर कर रहे हैं / SRM MRM परख विकास के लिए सबसे अच्छा चित्रा 2 से पता चलता है स्पेक्ट्रम एमएस / एमएस और चयनित संक्रमण आयनों&gt; 476.3 579.3 508.3, , पेप्टाइड GDSLAYGLR के लिए (भारी स्थिर आइसोटोप 481.3 मानक के लिए बदलाव नहीं पता चला&gt; 518.3, 589.3, 702.4) 692.4. </li><li> और मास स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग किया जाता मॉडल पर निर्भर करता है, वहाँ कई मापदंडों कि प्रत्येक संक्रमण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है है कर रहे हैं. यहाँ, हम टक्कर ऊर्जा ramping और संकेत के स्तर की निगरानी के द्वारा प्रत्येक चयनित संक्रमण की टक्कर ऊर्जा अनुकूलित. 25 के एक टक्कर ऊर्जा प्रत्येक संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया गया था. </li><li> संक्षेप में, एस आर एम / MRM विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट विन्यास के रूप में इस प्रकार है: मोबाइल चरण (एक) 0.1% चींटी एसिड, (बी) 90% Acetonitrile / 0.1% चींटी एसिड, 0.3 x 5 मिमी C18 जाल स्तंभ, 75 सुक्ष्ममापी आईडी x 15 सेमी C18 विश्लेषणात्मक स्तंभ (Reprosil - पुर C18 AQ, 120 ° ताकना). इंजेक्शन की मात्रा 10 μL है और नमूना कुल प्रवाह दर पर 3% बी पर 5 मिनट के लिए भरी हुई है μL 3 / मिनट और 3 से एक रेखीय ढाल से eluted - 300 पर 45% बी - 10 मिनट में 400 nl / मिनट. एक 4000 QTRAP (ABSCIEX, फोस्टर शहर, सीए) पर स्थितियां स्प्रे वोल्टेज 2.3kV, आयन स्रोत तापमान 150 डिग्री सेल्सियस, 12 की GS1 और पर्दे गैस 15. </li><li> नमूना SRM / MRM द्वारा नमूना के 10 μL इंजेक्शन लगाने के द्वारा विश्लेषण किया है. पीक क्षेत्रों प्रकाश और भारी कार्यक्रम क्षितिज का उपयोग पेप्टाइड्स के लिए एकीकृत कर रहे हैं प्रत्येक नमूने में unlabeled / लेबल पेप्टाइड सबसे प्रचुर मात्रा में संक्रमण है कि इस मामले में पृष्ठभूमि शोर से मुक्त है, का उपयोग कर के 14 चोटी क्षेत्र अनुपात (PAR) y5 संक्रमण की गणना. (प्रकाश पेप्टाइड 476.3 579.3&gt;, भारी मानक पेप्टाइड 481.3 589.3&gt;). </li></ol> 4. प्रतिनिधि परिणाम: मापाकरे चोटी क्षेत्र अनुपात (प्रकाश अंतर्जात पेप्टाइड बालीदार भारी isotopically लेबल पेप्टाइड के सापेक्ष) लक्ष्य पेप्टाइड का एक मात्रात्मक उपाय प्रदान चित्रा 3 SISCAPA समृद्ध एक नमूना में प्रकाश और भारी पेप्टाइड्स के एक उदाहरण chromatogram से पता चलता है. ध्यान दें कि एक ही समय में और कई बदलाव पर प्रकाश और भारी elute पेप्टाइड्स प्रत्येक पेप्टाइड करने के लिए पहचान की पुष्टि के लिए नजर रखी जा सकती है. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig1.jpg" alt="चित्रा 1"/> चित्रा 1. SISCAPA प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन. एक जटिल प्रोटीन मिश्रण पेप्टाइड में पचता है. लक्षित पेप्टाइड analytes (अंतर्जात analyte और नुकीला एक स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानक) विरोधी पेप्टाइड जी लेपित चुंबकीय कणों प्रोटीन पर immobilized एंटीबॉडी का उपयोग कर समृद्ध कर रहे हैं. अलगाव के बाद, लक्षित पेप्टाइड्स चुंबकीय कणों से eluted हैं और quantitation के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री आंतरिक मानक के सापेक्ष द्वारा विश्लेषण. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig2.jpg" alt="चित्रा 2"/> चित्रा 2. पेप्टाइड SRM / MRM संक्रमण के लिए तीन टुकड़े का चयन दिखा GDSLAYGLR एमएस / एमएस के स्पेक्ट्रम . <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig3.jpg" alt="चित्रा 3"/> चित्रा 3 उदाहरण chromatograms एक प्रकाश पेप्टाइड analyte के शिखर प्रोफ़ाइल (लाल) और भारी स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानक (नीला) दिखा. Chromatograms प्रकाश पेप्टाइड (476.3 579.3&gt;) और भारी स्थिर आइसोटोप लेबल से y5 संक्रमण के लिए मानक (481.3 589.3&gt;) समय पर प्लॉट किए जाते हैं के रूप में वे क्रोमैटोग्राफी प्रणाली से elute.

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	<li>Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+flaws+of+immunoassays+and+potential+solutions+using+tandem+mass+spectrometry.">The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).</li><li>Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+quantitation+of+peptides+and+proteins+using+Stable+Isotope+Standards+and+Capture+by+Anti-Peptide+Antibodies+(SISCAPA).">Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA).</a> J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).</li><li>Chace, D. H., Kalas, T. 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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम सुनिश्चित करने के मोती ऊष्मायन अवधि के दौरान अच्छी तरह से मिश्रित रहते हैं. मोती अच्छी तरह / शीशी के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दे परिवर्तनशीलता में वृद्धि हुई है परिणाम होगा. यह भी महत्वपूर्ण है किसी भी तरल है कि अच्छी तरह / शीशी के ऊष्मायन अवधि के बाद शीर्ष पर रह सकता है नीचे स्पिन. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य trypsin पाचन भी महत्वपूर्ण है. पाचन के लिए प्रक्रिया यहाँ वर्णित हमारी प्रयोगशाला में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया SISCAPA के साथ संयोजन के रूप में, तथापि, यह पाचन की संभावना वैकल्पिक तरीकों लक्ष्य प्रोटीन का एक दिया सेट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है मुक्त एंटीबॉडी के 15 Elution का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. पेप्टाइड, संभावना है क्योंकि एंटीबॉडी स्तंभ या elutes पेप्टाइड्स की तुलना में बाद से बाहर रखा गया है, लेकिन एंटीबॉडी प्रोटीन जी मोती Crosslinked प्रयोगों में बड़े या यदि मुक्त एंटीबॉडी आत्मीयता संवर्धन करने से पहले किया जा सकता है एक समस्या बन जाता है. हम भी यह autosampler पर नमूना थाली के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रवाह के विपरीत दिशा में जाल स्तंभ धोने के नीचे एक चुंबक (लोडिंग करने के लिए तुलना में) जगह के लिए किसी भी अवशिष्ट मोती या कणों को दूर करने के लिए उपयोगी पाया है. चुंबकीय मनका दृष्टिकोण वर्णित के अलावा, तकनीक भी एक स्तंभ स्वरूप (यानी आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है 12, 16 . एक बार उपयोगकर्ता समग्र प्रोटोकॉल के साथ सहज है, तकनीक भी कई संशोधनों कि समग्र परख बढ़ाने के लिए उत्तरदायी 11 सबसे पहले, यह संभव है एक ही परख में संवर्धन कदम (यानी बहुसंकेतन) में एंटीबॉडी के संयोजन के द्वारा एकाधिक analytes विश्लेषण . मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ ही analytes की बड़ी संख्या का विश्लेषण करने में सक्षम है. दूसरा, मूल नमूना की मात्रा में वृद्धि परख की संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है.

<table border="1"><tbody><tr><th> सामग्री के नाम </th><th> कंपनी </th><th> सूचीपत्र संख्या </th></tr><tr><td> 1000ul दीप 96 अच्छी तरह से अच्छी तरह प्लेटें </td><td> Eppendorf </td><td> 951032786 </td></tr><tr><td> ओएसिस HLB 1 सीसी कारतूस थाली, Sep - पाक, 40 मिलीग्राम 96 अच्छी तरह से थाली </td><td> वाटर्स </td><td> 186003966 </td></tr><tr><td> किंगफिशर 96 अच्छी तरह से थाली </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> 97002540 </td></tr><tr><td> 96 ठीक है, सफेद दीवार प्लेट साफ़ </td><td> जैव - रेड </td><td> HSP9601 </td></tr><tr><td> 96 अच्छी तरह से थाली के लिए कवर पन्नी </td><td> Excelscientific </td><td> 12-169 </td></tr><tr><td> Axymat 96 अच्छी तरह से थाली के लिए सील चटाई </td><td> Axygen </td><td> 521-01-151 </td></tr><tr><td> एक्स पियर्स फिल्म </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> Z722502 </td></tr><tr><td> किंगफिशर पीसीआर चुंबक सिर के साथ चुंबकीय मनका प्रोसेसर </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> 9601 HSP </td></tr></tbody></table> तालिका 1: सामग्री <table border="1"><tbody><tr><th> सामग्री के नाम </th><th> कंपनी </th><th> सूचीपत्र संख्या </th><th> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </th></tr><tr><td> यूरिया </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> U6031 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma आधार </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (डीटीटी) </td><td> बींधना </td><td> 20291 </td><td> &quot;Dithiothreitol नहीं तौलना&quot; </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (आई ए एम) </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> I1149 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin गोल्ड </td><td> Promega </td><td> V5280 </td><td></td></tr><tr><td> प्रोटीन जी चुंबकीय मोती, 2.8um </td><td> Invitrogen </td><td> 10004D </td><td></td></tr><tr><td> फास्फेट-buffered खारा (पीबीएस) </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> L5401 </td><td></td></tr><tr><td> Chaps </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> 28300 </td><td></td></tr><tr><td> चींटी एसिड </td><td> ईएमडी </td><td> 11670 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> थर्मो फिशर साइंटिफिक </td><td> A998-1 </td><td></td></tr><tr><td> एसिटिक एसिड </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> 242853 </td><td></td></tr></tbody></table> टेबल 2: अभिकर्मकों <table border="1"><tbody><tr><th> समाधान </th><th> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </th></tr><tr><td> 100 मिमी Tris 8 पीएच </td><td></td></tr><tr><td> एम 9 / 100 मिमी Tris (8 पीएच) में यूरिया 30 मिमी डीटीटी </td><td> हर बार नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए </td></tr><tr><td> 500 मिमी 100 मिमी Tris में आई ए एम (8 पीएच) </td><td> हर बार नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए </td></tr><tr><td> 100 मिमी Tris 8 पीएच में trypsin 1mg/mL </td><td></td></tr><tr><td> 100 मिमी Tris 8 पीएच में trypsin अवरोध करनेवाला 1mg/mL </td><td></td></tr><tr><td> स्थिर आइसोटोप मानक mastermix </td><td></td></tr><tr><td> विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी mastermix </td><td></td></tr></tbody></table> तालिका 3: समाधान के लिए तैयार रहना

quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

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Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

स्थिर आइसोटोप मानक और विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी (SISCAPA) जोड़े स्थिर आइसोटोप कमजोर पड़ने मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MRM एमएस) के साथ पेप्टाइड्स उनके संबंधित प्रोटीन के लिए surrogates के रूप में पेप्टाइड्स के मात्रात्मक माप प्रदान की आत्मीयता संवर्धन द्वारा कैप्चर. यहाँ हम एक आंशिक रूप से स्वचालित प्रारूप में चुंबकीय कणों का उपयोग प्रोटोकॉल का वर्णन.

मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित पेप्टाइड Immunoaffinity संवर्धन का उपयोग प्रोटीन की मात्रा का ठहराव

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI नमूना तैयार: अल्ट्रा पतली परत मेथड

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

खमीर Electrospray Ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर Lipidome के एक मात्रात्मक आकलन

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

स्ट्रक्चरल मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बड़े प्रोटीन परिसरों विश्लेषण

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

जी प्रोटीन रिसेप्टर युग्मित spectrally हल दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग सहभागिता के vivo मात्रा में

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Methyltransferases की रूपरेखा और अन्य एस Adenosyl एल</subकैद यौगिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CCMS)> homocysteine ​​बाध्यकारी प्रोटीन

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Thiol redox आइसोटोप टैगिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री proteome रूपरेखा

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

में प्रोटीन परिसरों की पहचान<em&gt; Escherichia कोलाई</em&gt; संयोजन में अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ अनुक्रमिक पेप्टाइड संबंध शुद्धीकरण का उपयोग

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

कैद यौगिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री - उपन्यास सी-डि-जीएमपी effector के प्रोटीन की पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

निरपेक्ष प्रोटीन की मात्रा के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री निगरानी चयनित रिएक्शन

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए पेप्टाइड में ऊतकों और पाचन से बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के संवर्धन

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...