Name: quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry
Uploaded: 2011-07-31T14:00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry at JoVE.com

Эта работа финансировалась NCI Клинические протеомных технологии Assessment Center (CPTAC) гранта (# U24 CA126476), а также грант от индустрии развлечений Foundation (РКРП) и Cancer Research EIF Женский фонд для биомаркеров груди Консорциум Discovery Рака, и щедрые подарки от фонда Кека, Канарские Фонда и Пол Г. Аллен Фонд семьи.

Экспериментальные процедуры: Анализ требует синтетические пептиды и анти-пептидных антител. Выбранный пептиды должны быть уникальными для белок, содержат от 8 до 22 аминокислот, и не известно пост-трансляционной модификации. Метионин остатков, как правило, избегали и пептиды, содержащие двухосновных аминокислот (например, KK, KR, РР) нежелательны. Для реализации этой технологии, она является общей для использования стабильных изотопов в качестве меченых пептидов внутренние стандарты, включая тяжелые (13 С и 15 N) меченых аминокислот на С-конце пептида (т.е. К или R помечены). Следующий протокол описывает анализа разработана для измерения пептид GDSLAYGLR от Остеопонтин белка мыши, используя анти-пептидных антител, полученных от Epitomics Inc (Burlingame, CA) и синтетических пептидов из Новой Англии пептида (Гарднер, М. А.). Протокол состоит из трех основных этапов (рис. 1): 1) Трипсин переваривания сложную смесь белков, 2) Обогащение пептиды 3) Анализ масс-спектрометрии. Он будет продемонстрирован на человека образце плазмы с шипами белка остеопонтина мыши. 1. Трипсин ферментативного пищеварения и очистки <ol><li> Оттепель 10 мкл аккуратные аликвоты плазмы на льду. </li><li> Определение общей концентрации белка с помощью анализа ДСС и центрифуги образец для удаления взвешенных твердых частиц. </li><li> Внесите 10 мкл от его хранения трубки 1000 мкл пластины Дипуэлл и накрыть Pierce-в состоянии фильма. </li><li> Добавьте 20 мкл свежей 9 месяцев мочевины / 30mm дитиотреитол (DTT) (конечная концентрация 6М мочевины / 20 мМ DTT) для каждого образца. </li><li> Инкубировать 30 минут при 37 ° C. </li><li> Добавить 3 мкл свежей 500 мМ iodoacetamide (окончательный IAM 50 мм) для каждого образца. </li><li> Инкубируйте в течение 30 минут в темном месте при комнатной температуре. </li><li> Добавить 257 мкл 100 мМ трис (рН 8) (разбавляет мочевины до ~ 0,6 М). </li><li> Добавьте 10 мкл исходного раствора трипсина (1 мкг / мкл, для 1:50 фермент: субстрат отношение). </li><li> Инкубируйте 37 ° С в течение ночи (12-16 часов). </li><li> Добавить 3 мкл аккуратные муравьиной кислоты (конечной концентрации 1%). </li><li> Добавить стабильный изотоп стандартных (множественные стандарты добавляется, если выполнение мультиплексный анализ, как правило, это около 10 мкл содержащего 50-100 фмоль стандартной изотопно меченного пептида). </li><li> Промыть пластины Oasis картридж хорошо с 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитрила, отбрасывая проточные. Повторите это 3 раза. </li><li> Равновесия картридж пластины, добавив 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде, и отбросить проточные. Повторите 4 раза. </li><li> Нагрузка переварить образцы пластину картриджа и регулировать вакуум таким потоком идет очень медленно. </li><li> Промыть 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде, и отбросить проточные. Повторите это 3 раза. </li><li> Элюции пептидов, добавив 2 х 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитрила в 1000 мкл глубоких скважин пластины (не выбрасывайте проточные). </li><li> Lyophilize (или speedvac) элюата досуха. (Лиофилизации является предпочтительным методом) </li><li> Развести сухой пептидов добавлением 50 мкл PBS + 0,03% CHAPS. </li></ol> 2. Пептид иммуноаффинной обогащения <ol><li> Передача образца стандартных Kingfisher 96-луночных. </li><li> Добавьте 1 мкг антител и 1,5 мкл белка-G покрытием магнитных гранул в год (это не является обязательным для сшивания антитела к бисера перед добавлением). Обеспечить бисер хорошо подвешен при встряхивании или вортексе. </li><li> Обложка пластинки с пленкой. </li><li> Инкубируйте ночь (12-16 часа) с нежным акробатика для обеспечения бисер приостановлено. </li><li> Центрифуга пластины на 32 мкг в течение 5 секунд, чтобы удалить жидкость из поверхности фольги. </li><li> Удалить фольгу крышку. </li><li> Стиральные и элюирование бусины могут быть выполнены вручную или в автоматическом режиме. Эта процедура описывает шаги автоматизированы на Kingfisher платформы. </li><li> Вымойте бисером 2 раза с 200 мкл PBS + 0,03% CHAPS (1 минута за мытье). </li><li> Вымойте бисером 1 раз в 200 мкл 1:10 разбавление PBS + 0,03% CHAPS (1 минута). </li><li> Пептиды элюировали в 25 мкл 5% уксусной кислоты + 0,03% CHAPS. </li><li> Место элюирования пластину на магнит и передачи элюата в 96 ячейках, заботясь не передавать остатки бус. </li><li> Обложка пластинки с уплотнением мат. </li><li> Пластины, содержащей элюата доставляется тройной quadrapole масс-спектрометр для анализа. </li></ol> 3. Анализ по нескольким мониторинга реакции - масс-спектрометрии <ol><li> Переходы для SRM / MRM анализа могут быть выбраны и оптимизированы вливая 1 picomole на микролитр решение пептид стандарт в 30% acetonitrile/0.1% муравьиной кислоты в масс-спектрометр на 0,5 мкл / мин. После стабильного распыления получается, собирать MS / MS спектра. </li><li> Переходы выбираются из MS / MS спектр путем выявления Автошоуэлектронной обильные ионов фрагмента в области спектра с небольшим шумом. Для многозарядных ионов пептид, у-ионные фрагменты обнаружены на т / г&gt; предшественником т / г, как правило, лучше всего для SRM / MRM анализа развития. Рисунок 2 показывает, MS / MS спектр и отдельных ионов переходных 476,3&gt; 508,3, 579,3 , 692,4 (переходы для тяжелого стабильного изотопа стандартных 481,3&gt; 518,3, 589,3, 702,4 не показан) для пептида GDSLAYGLR. </li><li> В зависимости от марки и модели использован масс-спектрометр, Есть несколько параметров, которые могут быть оптимизированы для каждого перехода. Здесь, мы оптимизировали столкновения энергия каждого выбранного перехода наращивает энергию столкновения и мониторинга уровня сигнала. Энергии столкновения в 25 был использован для каждого перехода. </li><li> Одним словом, типичная конфигурация для SRM / MRM анализа выглядит следующим образом: Подвижная фаза () 0,1% муравьиной кислоты; (б) 90% ацетонитрил / 0,1% муравьиной кислоты, 0,3 х 5 мм C18 колонка ловушка, 75 мкм ID х 15 см C18 аналитическую колонку (Reprosil-Пур C18 AQ, 120 A ° поры). Инъекции объемом 10 мкл и образец загружается в течение 5 минут при 3% B на общую скорость потока 3 мкл / мин и элюировали линейным градиентом от 3 - 45% В при 300 - 400 Нл / мин в течение 10 мин. Условия на 4000 QTRAP (ABSCIEX, Foster City, CA) были брызги напряжения 2.3kV, ионная температура источника 150 ° С, GS1 12, и занавес газа 15. </li><li> Образец проанализирован SRM / MRM путем введения 10 мкл образца. Пик областях интегрированы для легких и тяжелых пептидов с помощью программы Skyline. 14 Рассчитать пик соотношение площади (PAR) немеченого / меченого пептида в каждом примера с использованием наиболее распространенных перехода, который свободен от фонового шума, в данном случае, переход y5 (светло пептид 476,3&gt; 579,3, тяжелые стандартных пептидных 481,3&gt; 589,3). </li></ol> 4. Представитель Результаты: Измеренные пик соотношения площади (свет эндогенных относительной пептид шипами тяжелых изотопно меченного пептида) обеспечивают количественную меру целевой пептид. Рисунок 3 показывает пример хроматограммы легких и тяжелых пептидов в SISCAPA обогащенного образца. Обратите внимание, что легкие и тяжелые пептидов элюируются в то же время и многочисленные переходы можно отслеживать для каждого пептида для подтверждения личности. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig1.jpg" alt="Рисунок 1"/> Рисунок 1. Схематический обзор процесса SISCAPA. Сложная смесь белка усваивается на пептиды. Целевые пептидных аналитов (эндогенные аналита и шипами стабильного изотопа меченных внутренний стандарт) обогащены с использованием анти-пептидных антител иммобилизованных на Protein G-покрытием магнитных частиц. После изоляции, целевые пептиды элюируют из магнитных частиц и проанализированы масс-спектрометрии для количественного относительно внутреннего стандарта. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig2.jpg" alt="Рисунок 2"/> Рисунок 2. MS / MS спектр пептидных GDSLAYGLR показывает выбор из трех фрагментов для SRM / MRM переходами. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig3.jpg" alt="Рисунок 3"/> Рисунок 3. Пример хроматограммы показывает пик профиля свет анализируемого пептида (красный) и тяжелый стабильный изотоп меченных внутреннего стандарта (синий). Хроматограммы для y5 переход от света пептид (476,3&gt; 579,3) и тяжелого стабильного изотопа помечены стандарт (481,3&gt; 589,3) нанесены в течение долгого времени, как они элюируются из хроматографии системы.

<ol>
	<li>Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+flaws+of+immunoassays+and+potential+solutions+using+tandem+mass+spectrometry.">The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).</li><li>Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+quantitation+of+peptides+and+proteins+using+Stable+Isotope+Standards+and+Capture+by+Anti-Peptide+Antibodies+(SISCAPA).">Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA).</a> J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).</li><li>Chace, D. H., Kalas, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+perspective+on+the+use+of+tandem+mass+spectrometry+for+newborn+screening+and+clinical+testing.">A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing.</a> Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).</li><li>Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+role+of+mass+spectrometry+in+metabolite+profiling+and+characterization.">The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization.</a> Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).</li><li>Barr, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+dilution--mass+spectrometric+quantification+of+specific+proteins:+model+application+with+apolipoprotein+A-I.">Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I.</a> Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).</li><li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+C-reactive+protein+in+the+serum+of+patients+with+rheumatoid+arthritis+using+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+and+13C-labeled+peptide+standards.">Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards.</a> Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).</li><li>Whiteaker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+enrichment+of+peptides+on+magnetic+beads+for+mass-spectrometry-based+quantification+of+serum+biomarkers.">Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers.</a> Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).</li><li>Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+thyroglobulin,+a+low-abundance+serum+protein,+by+immunoaffinity+peptide+enrichment+and+tandem+mass+spectrometry.">Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry.</a> Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).</li><li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Multiplexed+Assays+for+Troponin+I+and+Interleukin-33+in+Plasma+by+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+and+Targeted+Mass+Spectrometry.">Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry.</a> Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).</li><li>Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+multiplexed+method+for+high+throughput+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry-based+quantification+of+protein+biomarkers.">An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).</li><li>Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+high-flow+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+nanoflow+LC-MS/MS:+assay+development+for+total+salivary+pepsin/pepsinogen.">Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen.</a> Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).</li><li>Ackermann, B. L., Berna, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+immunoaffinity+techniques+with+MS+for+quantitative+analysis+of+low-abundance+protein+biomarkers.">Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers.</a> Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).</li><li>MacLean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).</li><li>Proc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+study+of+the+effects+of+chaotropic+agents,+surfactants,+and+solvents+on+the+digestion+efficiency+of+human+plasma+proteins+by+trypsin.">A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin.</a> J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).</li><li>Berna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+immunoaffinity+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry+determination+of+a+type+II+collagen+peptide+biomarker+in+rat+urine:+Investigation+of+the+impact+of+collision-induced+dissociation+fluctuation+on+peptide+quantitation.">Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation.</a> Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Наиболее важным шагом в протокол, как описано, является обеспечение бисером остаются хорошо перемешанных в течение инкубационного периода. Разрешение бисером осели на дно колодца / флакон приведет к увеличению изменчивости. Важно также, чтобы спин-вниз любой жидкости, которые могут остаться на вершине и / флакон следующие инкубационного периода. Воспроизводимые пищеварения трипсина также имеет важное значение. Процедуры для пищеварения, описанные здесь был использован широко в нашей лаборатории совместно с SISCAPA, однако, вполне вероятно, альтернативные методы пищеварения может быть оптимизирована для данного набора белков-мишеней 15 Элюирование свободных антител не мешает обнаружению. пептид, вероятно, потому что антитела, исключается из столбца или элюируется позднее пептидов, но антитела могут быть сшиты с гранулами Protein G до близости обогащения в крупных экспериментов или при наличии свободных антител становится проблемой. Кроме того, мы сочли целесообразным поместить магнит ниже образец пластина на автосамплером а также стирку ловушку колонки в обратном направлении потока (по сравнению с загрузкой), чтобы удалить остатки бисера или частиц. В дополнение к магнитной бусины подход, описанный, метод также может быть адаптирована к колонке формате (т.е. аффинная хроматография). 12, 16 После того как пользователь комфортно с общим протоколом, техника также поддаются несколько модификаций, которые повышают общий анализ. 11-первых, это возможность анализировать несколько аналитов в одном анализе, комбинируя антитела в обогащении шаг (т.е. мультиплексирование). Масс-спектрометр, способный одновременно анализировать большое количество аналитов. Во-вторых, увеличение объема исходного образца повышает чувствительность анализа.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название материала </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> 1000ul глубоких скважин 96-луночных </td><td> Эппендорф </td><td> 951032786 </td></tr><tr><td> Oasis HLB 1 мл картридж плиты, сентябрь-пак, 40 мг 96 ячейках </td><td> Воды </td><td> 186003966 </td></tr><tr><td> Kingfisher 96 ячейках </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 97002540 </td></tr><tr><td> Открытый 96 лунок, белая пластина стене </td><td> Bio-Rad </td><td> HSP9601 </td></tr><tr><td> Фольга крышки для 96-луночного планшета </td><td> Excelscientific </td><td> 12-169 </td></tr><tr><td> Axymat Уплотнительная коврик для 96-луночного планшета </td><td> Axygen </td><td> 521-01-151 </td></tr><tr><td> X пробить фильм </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z722502 </td></tr><tr><td> Kingfisher магнитной бусины процессор с головой магнит ПЦР </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> HSP 9601 </td></tr></tbody></table> Таблица 1: Материалы <table border="1"><tbody><tr><th> Название материала </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии (необязательно) </th></tr><tr><td> Мочевина </td><td> Sigma Aldrich </td><td> U6031 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma базы </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Дитиотреитол (DTT) </td><td> Проколоть </td><td> 20291 </td><td> &quot;Нет-весить дитиотреитол&quot; </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> I1149 </td><td></td></tr><tr><td> Трипсин золото </td><td> Promega </td><td> V5280 </td><td></td></tr><tr><td> Protein G магнитных бус, 2.8um </td><td> Invitrogen </td><td> 10004D </td><td></td></tr><tr><td> Фосфат-солевом буфере (PBS) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> L5401 </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 28300 </td><td></td></tr><tr><td> Муравьиная кислота </td><td> EMD </td><td> 11670 </td><td></td></tr><tr><td> Ацетонитрил </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> A998-1 </td><td></td></tr><tr><td> Уксусная кислота </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 242853 </td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 2: Реагенты <table border="1"><tbody><tr><th> Решение </th><th> Комментарии (необязательно) </th></tr><tr><td> 100 мМ Трис рН 8 </td><td></td></tr><tr><td> 9 M мочевины / 30 мМ DTT в 100 мМ Трис (рН 8) </td><td> должен быть готов каждый раз свежее </td></tr><tr><td> 500 мМ IAM в 100 мМ Трис (рН 8) </td><td> должен быть готов каждый раз свежее </td></tr><tr><td> Трипсин 1mg/mL в 100 мМ Трис рН 8 </td><td></td></tr><tr><td> Ингибитор трипсина 1mg/mL в 100 мМ Трис рН 8 </td><td></td></tr><tr><td> Стабильный изотоп стандартных Mastermix </td><td></td></tr><tr><td> Анти-пептид антител Mastermix </td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 3: решения должны быть подготовлены

quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry

Существует большая потребность в количественных тестов при измерении белков. Традиционные иммунологические сэндвич, в значительной степени считается золотым стандартом в количественной, связаны с высокой стоимостью, долгое время свинца и чреваты недостатки (например, гетерофильных антител, аутоантител помех, &quot;крюк-эффект») 1. Альтернативная методика является близость обогащения пептидов в сочетании с количественной масс-спектрометрии, как правило, называют SISCAPA (Стабильный Стандарты Изотопные и Capture Анти-пептидов Антитела) 2. В этой технике, близость обогащение пептиды со стабильной изотопного разбавления и обнаружения по отдельным / множественные реакции мониторинг масс-спектрометрии ( SRM / MRM-MS) обеспечивает количественное измерение пептидов в качестве суррогатов для соответствующих белков. SRM / MRM-МС хорошо установлена ​​для точного количественного определения малых молекул, 3, 4 и совсем недавно был адаптирован для измерения концентрации белков в плазме крови и клеточных лизатов. 5-7 Для достижения количественного определения белков, эти крупные молекулы перевариваются до Компонент пептидов использованием ферментов, таких как трипсин. Один или несколько выбранных пептиды, последовательность является уникальным для целевого белка в том, что виды (например, &quot;proteotypic&quot; пептидов) затем обогащенный из примера с использованием анти-пептидных антител и измеряется как количественными суррогаты для стехиометрической концентрации белка в образце. Таким образом, в сочетании с стабильным изотопного разбавления (SID) методов (например, шипами в стабильный изотоп меченый пептид стандарт), SRM / MRM может быть использован для измерения концентрации proteotypic пептидов в качестве суррогатов для количественного определения белков в сложных биологических матриц. Методы имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными иммуноанализа. Реагенты сравнительно дешевле генерировать, специфичность для аналита отлично, анализы могут быть очень мультиплексированных, обогащение может быть выполнена с аккуратным плазмы (без истощения требуется), и техника поддается широкий спектр белков или модификации интересов. 8-13 В этом видео мы демонстрируем основной протокол, как адаптировать к магнитной бусины платформы.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Стабильный Стандарты Изотопные и Capture Анти-пептидов Антитела (SISCAPA) пары близость обогащение пептиды со стабильной изотопного разбавления масс-спектрометрии (MRM-MS) для обеспечения количественного определения пептидов в качестве суррогатов для соответствующих белков. Здесь мы опишем протокол с использованием магнитных частиц в частично автоматизированные формате.

Количественная оценка Белки Использование пептидов обогащению иммуноаффинной В сочетании с масс-спектрометрии

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Количественная оценка Дрожжи Lipidome использованием Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Анализ Большие белковые комплексы структурных масс-спектрометрии

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

В естественных условиях Количественная оценка G белком рецептор взаимодействий с использованием спектрально Решено Двухфотонное микроскопии

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Профилирование метилтрансферазы и других S-Аденозил- L-Гомоцистеин-связывающих белков Захват соединения масс-спектрометрия (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Профилирование тиоловых Редокс Протеом Использование изотопной масс-спектрометрии тегов

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Определение белковых комплексов в<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Захват соединения масс-спектрометрия - мощный инструмент для идентификации новых гр-ди-GMP эффекторных белков

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Выбранный мониторинга реакций масс-спектрометрии для абсолютного белка количественной

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Обогащение белков внеклеточного матрикса из тканей и пищеварения в пептидов для анализа масс-спектрометрии

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...