Name: lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells at JoVE.com

Wij danken L. Douay en MC Giarratana (Universite Paris VI, Frankrijk) voor advies over de ex vivo erytroïde differentiatie, D. Allan en H. Atkins (Ohří, Canada) voor het leveren van bloedmonsters (verkregen in het kader van de Ottawa Hospital Research Ethics board # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) voor het verstrekken van de lentivirale vectoren en FJ Dilworth (Ohří, Canada) voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit project werd gefinancierd door een subsidie ​​CIHR (MOP-82813) om MBCGP is een ontvanger van een Ontario Research Fund Computational Regulomics Training Postdoctoraal Fellowship. MB houdt de Canada Research Chair in de regulatie van genexpressie.

Part I. ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem/progenitor cells
1. Isolation of CD34+ human hematopoietic stem/progenitor cells
Human CD34+ cell population, which contains a mixture of hematopoietic stem cells (HSCs) and early progenitors 8, 
is harvested from umbilical cord blood, peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis) or bone marrow (Figure 1-Step1). If using cord blood or peripheral 
blood, go direct...

<ol>
	<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li><li>Kim, S. I., Bresnick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+erythropoiesis:+emerging+mechanisms+and+principles.">Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles.</a> Oncogene. 26, (2007).</li><li>Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocytic+maturation+in+vitro+of+murine+(Friend)+virus-induced+leukemic+cells.">Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).</li><li>Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid-cell-specific+properties+of+transcription+factor+GATA-1+revealed+by+phenotypic+rescue+of+a+gene-targeted+cell+line.">Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line.</a> Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).</li><li>Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotential+leukemia+cell+line+(K-562)+of+human+origin.">A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).</li><li>Giarratana, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells.">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).</li><li>Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+normal+hematopoietic+and+leukemia+stem+cell+hierarchy.">Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).</li><li>Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+lentivirus-mediated+gene+transfer+and+sustained+transgene+expression+in+human+hematopoietic+primitive+cells+and+their+progeny.">Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny.</a> Mol Ther. 6, 673-677 (2002).</li><li>Laurenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+and+shRNA+expression+in+resident+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo.</a> Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).</li><li>Palii, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+genomic+targeting+of+the+transcription+factor+TAL1+in+alternate+haematopoietic+lineages.">Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages.</a> EMBO J. 30, 494-509 (2011).</li><li>Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+maturation+of+human+erythroid+progenitors+in+liquid+culture.">Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture.</a> Blood. 73, 100-103 (1989).</li><li>Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+major+blood+group+antigens+on+human+erythroid+cells+in+a+two+phase+liquid+culture+system.">Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system.</a> Blood. 75, 505-511 (1990).</li><li>Sui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin-independent+erythrocyte+production:+signals+through+gp130+and+c-kit+dramatically+promote+erythropoiesis+from+human+CD34++cells.">Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells.</a> J Exp Med. 183, 837-845 (1996).</li><li>Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+human+stem+cell+factor/erythropoietin-dependent+erythroid+progenitor+cells+in+vitro.">Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro.</a> Blood. 92, 3658-3668 (1998).</li><li>Lindern, M. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glucocorticoid+receptor+cooperates+with+the+erythropoietin+receptor+and+c-Kit+to+enhance+and+sustain+proliferation+of+erythroid+progenitors+in+vitro.">The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro.</a> Blood. 94, 550-559 (1999).</li><li>Freyssinier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+characterization+of+a+population+of+human+erythroid+progenitors.">amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors.</a> Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).</li><li>Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+human+red+blood+cell+production+from+hematopoietic+progenitor+cells.">An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 91, 2664-2671 (1998).</li><li>Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-3+has+a+nonapoptotic+function+in+erythroid+maturation.">Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation.</a> Blood. 103, 4310-4316 (2004).</li><li>Mazurier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+and+efficient+selection+of+human+transduced+primitive+hematopoietic+cells+using+the+humanized+S65T+green+fluorescent+protein.">Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein.</a> Gene Ther. 5, 556-562 (1998).</li><li>Salmon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+transgene+expression+in+human+hematopoietic+progenitors+and+differentiated+blood+lineages+after+transduction+with+improved+lentiviral+vectors.">High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors.</a> Blood. 96, 3392-3398 (2000).</li></ol>

Een aantal methoden zijn eerder gebruikt om de cellen te differentiëren erythroïde in cultuur met een variabele mate van succes. Bijvoorbeeld, sommige protocollen zonder co-cultuur op de MS-5 maakt uitbreiding van erythroïde cellen, maar zijn niet efficiënt in het produceren van volledig rijpe enucleated rode bloedcellen 12-17. Terwijl andere methoden is het mogelijk een efficiënte enucleatie, is het ten koste van de proliferatie 18,19. De methode die we hier hebben gebruikt, in eerste instant...

lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells

Erytropoëse is een veel gebruikte modelsysteem om celdifferentiatie te bestuderen. Tijdens de erytropoëse, pluripotente volwassen humane hematopoietische stamcellen (HSC) differentiëren in oligopotent voorvaderen, betrokken precursoren en rijpe rode bloedcellen 1. Dit proces wordt geregeld voor een groot deel op het niveau van genexpressie, waarbij specifieke transcriptiefactoren te activeren lijn-specifieke genen, terwijl gelijktijdig het onderdrukken van genen die specifiek zijn voor andere soorten cellen 2. Studies over transcriptiefactoren reguleren erytropoëse worden vaak uitgevoerd met behulp van mensen en muizen cellijnen die, vertegenwoordigen tot op zekere hoogte, erythroïde cellen bij gegeven stadia van differentiatie 3-5. Maar getransformeerde cellijnen kan slechts gedeeltelijk nabootsen erythroïde cellen en het belangrijkste is dat het niet mogelijk om een ​​begrijpelijk studie van de dynamische veranderingen die de vooruitgang als cellen ontstaan ​​door vele podia naar hun uiteindelijke erythroid lot. Daarom is een actuele uitdaging blijft de ontwikkeling van een protocol bij relatief homogene bevolking van de primaire HSC en erythroïde cellen te verkrijgen in verschillende stadia van differentiatie in hoeveelheden die voldoende zijn om genomics en proteomics experimenten uit te voeren. Hier beschrijven we een ex vivo celkweek-protocol om erythroïde differentiatie te induceren van humane hematopoietische stam / voorlopercellen die zijn geïsoleerd van beide navelstrengbloed, beenmerg, perifeer bloed of volwassen gemobiliseerd met G-CSF (leukaferese). Deze cultuur-systeem, in eerste instantie ontwikkeld door de Douay laboratorium 6, maakt gebruik van cytokines en co-cultuur op mesenchymale cellen na te bootsen het beenmerg micro-omgeving. Met behulp van deze ex vivo differentiatie protocol, zien we een sterke versterking van erytroïde voorouders, een inductie van differentiatie enkel ten aanzien van de erytroïde lijn en een volledige rijping van het stadium van enucleated rode bloedcellen. Zo, dit systeem biedt de mogelijkheid om het moleculaire mechanisme van transcriptionele regulatie als hematopoietische stamcellen vooruitgang langs de erytroïde lijn te bestuderen. Studeren erytropoëse op het transcriptionele niveau vereist ook de mogelijkheid om over-express of knockdown specifieke factoren in primaire erythroid cellen. Hiervoor maken we gebruik van een lentivirus-gemedieerde gen-levering systeem dat zorgt voor de efficiënte infectie van zowel delende als niet-delende cellen 7. Hier laten we zien dat we in staat zijn om efficiënt te knockdown de transcriptiefactor TAL1 in primaire menselijke erythroid cellen. Daarnaast, GFP expressie toont een rendement van lentivirale infectie bijna 90%. Zo, onze-protocol zorgt voor een zeer nuttig systeem voor de karakterisering van de regulerende netwerk van transcriptiefactoren die controle erythropoiese.

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells at JoVE.com

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Protocol om te rijpen menselijke rode bloedcellen uit hematopoietische stamcellen / voorlopers genereren is beschreven. Daarnaast beschrijven we een efficiënte lentivirale-delivery methode om knockdown de transcriptiefactor TAL1 in primaire erythroid cellen. De efficiëntie van lentivirus gemedieerde gen delivery is aangetoond met behulp van GFP uiten van virussen.

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Passaging Human Neural Stem Cells

Passage menselijke neurale stamcellen

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Isolatie van Vroege hematopoietische stamcellen van muizen dooierzak en AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo cultuur van muis embryonale Huid en live-beeldvorming van melanoblast Migratie

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...