Name: lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00
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Wir danken L. Douay und MC Giarratana (Université Paris VI, Frankreich) für Beratung bei der ex vivo erythroiden Differenzierung, D. Allan und H. Atkins (Ohří, Kanada) für die Bereitstellung von Blutproben (erhalten unter der Ottawa Hospital Research Ethics Board # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne) für die Bereitstellung der lentiviralen Vektoren und FJ Dilworth (Ohří, Kanada) für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Dieses Projekt wurde von einem CIHR gewähren (MOP-82813), um MBCGP finanziert ist ein Empfänger einer Ontario Research Fund Computational Regulomics Ausbildung Postdoktoranden-Stipendium. MB hält den Canada Research Chair in der Regulation der Genexpression.

Part I. ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem/progenitor cells
1. Isolation of CD34+ human hematopoietic stem/progenitor cells
Human CD34+ cell population, which contains a mixture of hematopoietic stem cells (HSCs) and early progenitors 8, 
is harvested from umbilical cord blood, peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis) or bone marrow (Figure 1-Step1). If using cord blood or peripheral 
blood, go direct...

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Eine Reihe von Methoden wurden bereits zu erythroiden Zellen in Kultur zu differenzieren mit variabler Grad von Erfolg eingesetzt. Zum Beispiel können einige Protokolle ohne Co-Kultur auf MS-5 Ausbau der erythroiden Zellen sind aber nicht in der Herstellung von voll ausgereiften entkernte rote Blutkörperchen 12-17 effizient. Während bei anderen Methoden effizienter Enukleation ermöglichen, ist es auf Kosten der Verbreitung 18,19. Die Methode, die wir hier verwendet haben, zunächst von der Doua...

lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells

Erythropoese ist eine häufig verwendete Modellsystem zur Untersuchung der Zelldifferenzierung. Während Erythropoese, pluripotenten adulten humanen hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) in oligopotent Vorfahren, engagiert Vorläufern und reifen roten Blutkörperchen Zellen 1 zu unterscheiden. Dieser Prozess ist für einen großen Teil auf der Ebene der Genexpression, wobei spezifische Transkriptionsfaktoren aktivieren Linie-spezifischer Gene reguliert, während gleichzeitig unterdrücken Genen, die spezifisch für andere Zelltypen 2 sind. Studien über Transkriptionsfaktoren regulieren Erythropoese sind oft unter Verwendung von humanen und murinen Zelllinien, stellen zum Teil erythroiden Zellen zu bestimmten Stadien der Differenzierung 3-5. Allerdings transformierten Zelllinien nur teilweise imitieren erythroiden Zellen und vor allem sie nicht erlauben es, nachvollziehbar Studie der dynamischen Veränderungen, die als Zellen des Fortschritts ist möglich durch viele Stadien zu ihrer endgültigen erythroiden Schicksal. Somit bleibt eine aktuelle Herausforderung der Entwicklung eines Protokolls zu relativ homogenen Populationen von primären HSC und erythroiden Zellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung zu erhalten, die in Mengen, die ausreichen, Genomik und Proteomik Experimente durchzuführen sind. Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Zellkultur-Protokoll zu erythroiden Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen, die aus entweder Nabelschnurblut, Knochenmark oder dem peripheren Blut Erwachsener mit G-CSF (Leukapherese) mobilisiert wurden, isoliert zu induzieren. Diese Kultur zeichnet sich anfänglich durch die Douay Labor 6 entwickelt, nutzt Zytokine und Co-Kultur auf mesenchymale Zellen in die Knochenmark-Mikroumgebung nachahmen. Mit dieser ex vivo Differenzierung Protokoll, beobachten wir eine starke Verstärkung von erythroiden Vorläuferzellen, eine Induktion der Differenzierung ausschließlich auf die erythroiden Linie und eine vollständige Reifung auf der Bühne des entkernten roten Blutkörperchen. So bietet dieses System die Möglichkeit, den molekularen Mechanismus der Regulation der Transkription als hämatopoetische Stammzellen Fortschritte auf dem erythroiden Linie zu studieren. Studieren Erythropoese auf der Transkriptionsebene erfordert auch die Fähigkeit, über-express oder Knockdown spezifische Faktoren in primären erythroiden Zellen. Zu diesem Zweck verwenden wir ein Lentivirus-vermittelte Gentransfer-System, das für die effiziente Infektion von beiden Teilen und nicht teilende Zellen 7 ermöglicht. Hier zeigen wir, dass wir in der Lage, effizient Knockdown des Transkriptionsfaktors TAL1 in primären humanen erythroiden Zellen sind. Darüber hinaus zeigt die GFP-Expression mit einem Wirkungsgrad von lentiviralen Infektion fast 90%. So bietet unser Protokoll ein sehr nützliches System für die Charakterisierung des regulatorischen Netzwerkes von Transkriptionsfaktoren, die Steuerung der Erythropoese.

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Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Protokoll zur Erzeugung reifen menschlichen roten Blutkörperchen aus hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen beschrieben. Zusätzlich beschreiben wir eine effiziente lentivirale-Delivery-Methode Knockdown des Transkriptionsfaktors TAL1 in primären erythroiden Zellen. Die Effizienz der Lentivirus vermittelten Gentransfer nachgewiesen wird, mit GFP-exprimierenden Viren.

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Forschung

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Passaging Human Neural Stem Cells

Passagierung humaner neuraler Stammzellen

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Isolierung von Anfang hämatopoetischen Stammzellen aus Murine Dottersack und AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut-und-Live-Darstellung von Migration Melanoblasten

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...