Name: lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells
Uploaded: 2011-07-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells at JoVE.com

אנו מודים ל Douay ו MC Giarratana (אוניברסיטת פריס VI, צרפת) עצה על בידול vivo erythroid לשעבר, אלן ד &#39;וה&#39; אטקינס (OHRI, קנדה) למתן דגימות דם (שהושג לפי מחקר החולים אוטווה אתיקה עמוד # 2007804-01H), ד Trono (אקול פוליטכניק הפדרלי דה לוזאן) עבור מתן וקטורים lentiviral ו FJ דילוורת&#39; (OHRI, קנדה) עבור אנושות לקרוא את כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי מענק CIHR (MOP-82813) כדי MBCGP הוא מקבל מלגת קרן מחקר אונטריו הדרכה Regulomics חישובית דוקטורים. MB הקתדרה למחקר בקנדה בתקנה של ביטוי גנים.

Part I. ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem/progenitor cells
1. Isolation of CD34+ human hematopoietic stem/progenitor cells
Human CD34+ cell population, which contains a mixture of hematopoietic stem cells (HSCs) and early progenitors 8, 
is harvested from umbilical cord blood, peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis) or bone marrow (Figure 1-Step1). If using cord blood or peripheral 
blood, go direct...

<ol>
	<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoiesis:+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology.">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li><li>Kim, S. I., Bresnick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+erythropoiesis:+emerging+mechanisms+and+principles.">Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles.</a> Oncogene. 26, (2007).</li><li>Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocytic+maturation+in+vitro+of+murine+(Friend)+virus-induced+leukemic+cells.">Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).</li><li>Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid-cell-specific+properties+of+transcription+factor+GATA-1+revealed+by+phenotypic+rescue+of+a+gene-targeted+cell+line.">Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line.</a> Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).</li><li>Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotential+leukemia+cell+line+(K-562)+of+human+origin.">A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).</li><li>Giarratana, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells.">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).</li><li>Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+normal+hematopoietic+and+leukemia+stem+cell+hierarchy.">Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).</li><li>Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+lentivirus-mediated+gene+transfer+and+sustained+transgene+expression+in+human+hematopoietic+primitive+cells+and+their+progeny.">Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny.</a> Mol Ther. 6, 673-677 (2002).</li><li>Laurenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+and+shRNA+expression+in+resident+hematopoietic+stem+cells+in+vivo.">Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo.</a> Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).</li><li>Palii, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+genomic+targeting+of+the+transcription+factor+TAL1+in+alternate+haematopoietic+lineages.">Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages.</a> EMBO J. 30, 494-509 (2011).</li><li>Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+maturation+of+human+erythroid+progenitors+in+liquid+culture.">Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture.</a> Blood. 73, 100-103 (1989).</li><li>Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+major+blood+group+antigens+on+human+erythroid+cells+in+a+two+phase+liquid+culture+system.">Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system.</a> Blood. 75, 505-511 (1990).</li><li>Sui, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin-independent+erythrocyte+production:+signals+through+gp130+and+c-kit+dramatically+promote+erythropoiesis+from+human+CD34++cells.">Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells.</a> J Exp Med. 183, 837-845 (1996).</li><li>Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+of+human+stem+cell+factor/erythropoietin-dependent+erythroid+progenitor+cells+in+vitro.">Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro.</a> Blood. 92, 3658-3668 (1998).</li><li>Lindern, M. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glucocorticoid+receptor+cooperates+with+the+erythropoietin+receptor+and+c-Kit+to+enhance+and+sustain+proliferation+of+erythroid+progenitors+in+vitro.">The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro.</a> Blood. 94, 550-559 (1999).</li><li>Freyssinier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+characterization+of+a+population+of+human+erythroid+progenitors.">amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors.</a> Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).</li><li>Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+human+red+blood+cell+production+from+hematopoietic+progenitor+cells.">An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 91, 2664-2671 (1998).</li><li>Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-3+has+a+nonapoptotic+function+in+erythroid+maturation.">Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation.</a> Blood. 103, 4310-4316 (2004).</li><li>Mazurier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+and+efficient+selection+of+human+transduced+primitive+hematopoietic+cells+using+the+humanized+S65T+green+fluorescent+protein.">Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein.</a> Gene Ther. 5, 556-562 (1998).</li><li>Salmon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+transgene+expression+in+human+hematopoietic+progenitors+and+differentiated+blood+lineages+after+transduction+with+improved+lentiviral+vectors.">High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors.</a> Blood. 96, 3392-3398 (2000).</li></ol>

מספר שיטות שימשו בעבר להבדיל תאים erythroid בתרבות עם דרגות משתנות של הצלחה. לדוגמה, כמה פרוטוקולים ללא תרבות משותפת על MS-5 מאפשרת הרחבה של תאים erythroid אך אינם יעילים בהפקת לבגרות מלאה בתאי דם אדומים enucleated 12-17. בעוד שיטות אחרות לאפשר enucleation יעיל, זה על חשבונם של התפשטות ...

lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells

Erythropoiesis היא מערכת מודל נפוץ ללמוד התמיינות תאים. במהלך erythropoiesis, pluripotent אדם מבוגר hematopoietic בתאי גזע (HSCs) להתמיין אבות oligopotent, מבשרי מחויב ובוגרת כדוריות דם אדומות 1. תהליך זה מווסת על חלק גדול ברמה של ביטוי גנים, לפיו גורמי שעתוק ספציפיים להפעיל השושלת גנים ספציפיים במקביל תוך הדחקת גנים ספציפיים סוגי תאים אחרים 2. מחקרים על גורמי תעתוק ויסות erythropoiesis מבוצעות בדרך כלל באמצעות שורות תאים אנושיים המייצגות Murine, במידה מסוימת, תאים erythroid בשלבים נתון של בידול 3-5. שורות תאים יכולים להפוך זאת באופן חלקי בלבד לחקות תאים erythroid והכי חשוב הם לא מאפשרים אחד comprehensibly המחקר שינויים דינמיים המתרחשים התקדמות תאים בשלבים רבים לקראת גורלו הסופי erythroid שלהם. לכן, האתגר הנוכחי נותר פיתוח פרוטוקול להשיג אוכלוסיות הומוגניות יחסית של HSCs הראשי erythroid תאים בשלבים שונים של התמיינות בכמויות מספיקות כדי לבצע גנומיקה ניסויים proteomics. כאן אנו מתארים vivo לשעבר לתא תרבות פרוטוקול להשרות התמיינות erythroid מן האדם גזע / ובתאים hematopoietic שהיו מבודדים מהדם או טבורי, מח עצם או דם היקפי מבוגר מגויסת עם G-CSF (leukapheresis). מערכת זו תרבות, שפותחה לראשונה על ידי המעבדה Douay 6, משתמשת ציטוקינים ושיתוף תרבות על תאים mesenchymal לחקות את microenvironment מח עצם. שימוש בפרוטוקול לשעבר בידול vivo, אנו צופים הגברה חזקה של אבות erythroid, אינדוקציה של דיפרנציאציה אך ורק כלפי השושלת erythroid ו התבגרות להשלים לשלב enucleated כדוריות דם אדומות. לכן, מערכת זו מספקת הזדמנות ללמוד את המנגנון המולקולרי של ויסות תעתיק התקדמות בתאי גזע hematopoietic לאורך השושלת erythroid. לימוד erythropoiesis ברמה תעתיק גם דורש את היכולת גורמים ספציפיים מעל מפורשת או מציאה ב העיקרי תאים erythroid. לשם כך, אנו משתמשים lentivirus בתיווך משלוח גן מערכת המאפשרת זיהום יעיל של שניהם חלוקת ולא חלוקת תאים 7. כאן אנו מראים כי אנו מסוגלים ביעילות מציאה גורם שעתוק בתוך TAL1 העיקרי erythroid תאים אנושיים. בנוסף, ביטוי של GFP מדגים יעילות של זיהום lentiviral קרוב ל 90%. לפיכך, פרוטוקול שלנו מספק מערכת שימושית מאוד עבור אפיון של רשת רגולטורית של גורמי תעתוק כי erythropoiesis שליטה.

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells at JoVE.com

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; פרוטוקול לייצר תאים אנושיים בוגרים הדם האדומים מתוך גזע / אבות hematopoietic מתואר. בנוסף אנו מתארים שיטה יעילה משלוח lentiviral ל מציאה גורם שעתוק בתוך TAL1 העיקרי תאים erythroid. היעילות של משלוח גן בתיווך lentivirus מודגמת באמצעות וירוסים GFP להביע.

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Passaging Human Neural Stem Cells

Passaging אדם בתאי גזע עצביים

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...