Name: cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses
Uploaded: 2011-12-03T14:00:00
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Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal governo spagnolo &quot;Ministerio de Educación y Ciencia&quot; (progetto AGL2008-05275-C01/ALI), dall&#39;Unione Europea Quadro di Ricerca 7 progetti finanziati VIROBATHE (contratto n ° 513648), VIROCLIME (contratto n ° 243923 ) e dall&#39;Agenzia catalana di acqua, Agencia Catalana de l&#39;Aigua (ACA), Departament de controllo i Millora dels Ecosistemes Aquatics. Durante lo studio ha sviluppato Marta Rusiñol era un collega del governo catalano &quot;AGAUR&quot; (FI-DGR).

1. Concentrazione delle particelle virali presenti nei campioni di acqua <ol><li> Raccolta e condizionamento dei campioni di acqua <ol><li> Raccogliere un minimo di 2 repliche di 10 litri per campione in contenitori di plastica con fondo piatto e un campione in più come un controllo di processo. Questo ultimo esempio sarà arricchito con una quantità nota di particelle virali e utilizzato come controllo. Nota: Si raccomanda di avere particolari materiali utilizzati (bottiglie, tubi, ecc) per i campioni a spil...

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	<li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission.">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li><li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li><li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool.">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment.">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment.">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li><li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR.">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li><li>de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Mart&#237;n, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination.">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li><li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses.">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li><li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water.">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li><li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand.">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li></ol>

<html> La procedura descritta potrebbe soddisfare le condizioni per un metodo adatto per routine laboratori ambientali e sanitarie: riproducibile, affidabile, semplice e conveniente. Il protocollo è semplice, ma che devono essere seguite attentamente. Bassa conducibilità nei campioni senza aggiungere la concentrazione richiesta di sali di acqua di mare artificiale ridurrebbe drasticamente il recupero di virus come sarebbe il caso se il tempo di agitazione per la flocculazione è significativamente ridotto (meno di 5 or...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Centrifuga ad alta velocità (8.000 xg) </td><td> Berckman Coulter </td><td> Avanti J-20XP </td><td></td></tr><tr><td> pH-metro, termometro e conduttimetro </td><td> Afora </td><td> LPPC3003 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi di plastica 100-200 cm di lunghezza </td><td> DeltaLab </td><td> 350059 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette graduate sterili monouso </td><td> Labclinics </td><td> PN10E1 </td><td></td></tr><tr><td> Sterili tubi di plastica di 1,5 e 10-15 ml (Eppendorf, Falchi, ecc) </td><td> Afora </td><td> KA298/00 </td><td></td></tr><tr><td> Pentole centrifuga (500 ml) </td><td> Fisher Scientific </td><td> SE5753512 </td><td></td></tr><tr><td> Agitatori magnetici e magneti (uno percampione) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10510 </td><td></td></tr><tr><td> Contenitori di vetro o plastica, che ha fondo piatto per consentire l&#39;uso di agitatori magnetici </td><td> DeltaLab </td><td> 191642 </td><td></td></tr><tr><td> Una pompa peristaltica per la rimozione del surnatante (o un getto d&#39;acqua pompa del vuoto) </td><td> Watson-Marlow </td><td> 323E / D </td><td></td></tr><tr><td> Timer per lo spegnimento l&#39;agitazione dopo 8-10 ore </td><td> DeltaLab </td><td> 900400 </td><td></td></tr><tr><td> Acido cloridrico (1N e 0,1 N) </td><td> Panreac </td><td> 141020.1611 </td><td></td></tr><tr><td> Idrossido di sodio (1N) </td><td> Panreac </td><td> 131687.1211 </td><td></td></tr><tr><td> Artificiale con acqua di mare mare sali </td><td> Sigma </td><td> S9883 </td><td></td></tr><tr><td> Latte scremato (SM) </td><td> Difco </td><td> 232100 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone fosfato a pH 7, 5 </td><td></td><td></td><td> 01:02 v / v di sterile Na 2 HPO 4 0,2 M e NaH 2 PO 4 0,2 M a pH 7,5 </td></tr><tr><td> Tiosolfato </td><td> Panreac </td><td> 121879.1209 </td><td> Fai una soluzione al 10% in acqua </td></tr><tr><td> QIAamp Viral RNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 52904 </td><td></td></tr><tr><td> 96-pozzetti di reazione ottico (500 unità) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 43426659 </td><td></td></tr><tr><td> Ottico copre adesivo (100 unità) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Ambientale PCR Master Mix 2x </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr></tbody></table>

cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses

La contaminazione microbica dell&#39;ambiente rappresenta un rischio significativo per la salute. Classica indicatori batterici fecali hanno dimostrato di avere notevoli limitazioni, i virus sono più resistenti ai processi di inattivazione molti indicatori e standard fecale non informare sulla fonte di contaminazione. Lo sviluppo di metodi economici per la concentrazione di virus da acqua e saggi molecolari facilita l&#39;applicabilità di virus come indicatori di contaminazione fecale e come fonte microbica tracking (MST) strumenti. Adenovirus e poliomavirus sono virus a DNA infettare specie di vertebrati specifici compresi gli esseri umani e sono costantemente escreto nelle feci e / o urine in tutte le aree geografiche studiate. In studi precedenti, abbiamo suggerito la quantificazione di adenovirus umani (HAdV) e poliomavirus JC (JCPyV) mediante PCR quantitativa (qPCR) come indice di contaminazione fecale umana. Recentemente, abbiamo sviluppato saggi qPCR per la quantificazione specifica di poradenovirus cine (PAdV) e poliomavirus bovina (BPyV) come animali indicatori di contaminazione fecale con sensibilità di copie del genoma 1-10 per provetta. In questo studio, presentiamo la procedura da seguire per identificare la fonte di contaminazione nei campioni di acqua di questi strumenti. Come esempio dei risultati rappresentativi, l&#39;analisi dei virus nelle acque sotterranee presenta alti livelli di nitrati è mostrato. Individuazione di virus in acque inquinate o moderatamente bassa richiede la concentrazione del virus da almeno diversi litri di acqua in un volume molto più piccolo, una procedura che di solito comprende due fasi concentrazione in serie. Questa procedura alquanto complesso e la variabilità osservata in recuperi virale ostacolare in modo significativo l&#39;elaborazione simultanea di un gran numero di campioni di acqua. Al fine di eliminare il collo di bottiglia causato dai due procedure dettagliate abbiamo applicato un passo protocollo sviluppato in Studie precedentes ed applicabile ad una varietà di matrici acqua. La procedura prevede: l&#39;acidificazione di dieci litri di campioni di acqua, flocculazione da latte scremato, sedimentazione dei materiali flocculato, la raccolta del precipitato e centrifugazione, risospensione del precipitato in 10 ml di tampone fosfato. Il concentrato virale è utilizzato per l&#39;estrazione di acidi nucleici virali e l&#39;adenovirus specifico e poliomavirus di interesse sono quantificati da qPCR. Elevato numero di campioni può essere contemporaneamente analizzate con questo metodo a basso costo concentrazione. La procedura è stata applicata per l&#39;analisi delle acque di balneazione, l&#39;acqua di mare e di acqua di fiume e in questo studio, presentiamo i risultati analizzando campioni di acque sotterranee. Questo high-throughput metodo quantitativo è affidabile, semplice e conveniente.

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Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Lo studio descrive un metodo conveniente per l&#39;identificazione della fonte di contaminazione fecale / urina o la contaminazione da nitrati in acqua utilizzando qPCR per la quantificazione specifica di virus DNA umano / suini / bovini, adenovirus e poliomavirus, proposti come strumenti di MST.

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