Name: cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses
Uploaded: 2011-12-03T14:00:00
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Este trabajo fue parcialmente financiado por el Gobierno español &quot;Ministerio de Educación y Ciencia&quot; (proyecto AGL2008-05275-C01/ALI), por el Marco Europeo de Investigación de la Unión siete proyectos financiados VIROBATHE (Contrato N º 513.648), VIROCLIME (Contrato N º 243923 ) y por la Agencia Catalán de agua, Agència Catalana de l&#39;Aigua (ACA), Departamento de Control i Millora dels Ecosistemes acuáticos. Durante el estudio desarrollado Marta Rusiñol era un compañero del catalán Gobierno &quot;AGAUR&quot; (FI-DGR).

1. Concentración de las partículas virales presentes en muestras de agua <ol><li> Recolección y acondicionamiento de muestras de agua <ol><li> Recoger un mínimo de dos réplicas de 10 L por cada muestra en recipientes de plástico con fondo plano y una muestra adicional, como el control del proceso. Esta última muestra se enriquece con una cantidad conocida de partículas virales y se utiliza como control. Nota: Se recomienda contar con un material especial independiente (botellas, tubos, etc) para muestra...

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	<li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission.">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li><li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li><li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool.">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment.">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li><li>Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment.">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li><li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR.">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li><li>de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Mart&#237;n, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination.">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li><li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses.">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li><li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water.">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li><li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand.">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li></ol>

<html> El procedimiento descrito se cumplen las condiciones para un método de ajuste de rutina de los laboratorios de salud ambiental y pública: reproducible, fiable, sencillo y rentable. El protocolo es sencillo, sin embargo, deben seguirse estrictamente. Baja conductividad en las muestras sin necesidad de añadir la concentración de sales pidió agua de mar artificial reduciría dramáticamente la recuperación de los virus, como sería el caso si el tiempo de agitación para la floculación es significativamente re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Centrífuga de alta velocidad (8.000 xg) </td><td> Berckman Coulter </td><td> Avanti J-20XP </td><td></td></tr><tr><td> pH-metro, termómetro y conductímetro </td><td> Afora </td><td> LPPC3003 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de plástico 100-200 cm de longitud </td><td> Deltalab </td><td> 350059 </td><td></td></tr><tr><td> Se graduó pipetas desechables estériles </td><td> Labclinics </td><td> PN10E1 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos estériles de plástico de 1,5 y 10-15 ml (Eppendorf, halcones, etc) </td><td> Afora </td><td> KA298/00 </td><td></td></tr><tr><td> Ollas centrifugadora (500 mL) </td><td> Fisher Scientific </td><td> SE5753512 </td><td></td></tr><tr><td> Agitadores magnéticos e imanes (uno porde la muestra) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10510 </td><td></td></tr><tr><td> De vidrio o recipientes de plástico con fondo plano para permitir el uso de agitadores magnéticos </td><td> Deltalab </td><td> 191642 </td><td></td></tr><tr><td> Una bomba peristáltica para retirar el sobrenadante (o una bomba de vacío por chorro de agua) </td><td> Watson-Marlow </td><td> 323E / D </td><td></td></tr><tr><td> Temporizador para apagar la agitación después de 8-10 horas </td><td> Deltalab </td><td> 900400 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido clorhídrico (1 N y 0,1 N) </td><td> Panreac </td><td> 141020.1611 </td><td></td></tr><tr><td> Hidróxido de sodio (1N) </td><td> Panreac </td><td> 131687.1211 </td><td></td></tr><tr><td> Sales del agua de mar artificial mar </td><td> Sigma </td><td> S9883 </td><td></td></tr><tr><td> La leche desnatada (SM) </td><td> Difco </td><td> 232100 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de pH 7, 5 </td><td></td><td></td><td> 1:2 v / v de estériles Na 2 HPO 4 0,2 M y NaH 2 PO 4 0,2 M a pH 7,5 </td></tr><tr><td> Tiosulfato </td><td> Panreac </td><td> 121879.1209 </td><td> Prepare una solución de 10% en agua </td></tr><tr><td> QIAamp Viral RNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 52904 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 pocillos placa de reacción óptica (500 unidades) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 43426659 </td><td></td></tr><tr><td> Óptica cubre adhesivo (100 unidades) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan PCR Master Mix Ambiental 2x </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr></tbody></table>

cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses

La contaminación microbiana del medio ambiente representa un riesgo significativo para la salud. Clásicos indicadores fecales bacterianos han demostrado que tienen limitaciones significativas, los virus son más resistentes a procesos de inactivación y muchos indicadores estándar fecal no informan sobre la fuente de contaminación. El desarrollo de métodos eficientes para la concentración de virus a partir de agua y ensayos moleculares facilita la aplicación de los virus como indicadores de contaminación fecal y herramientas de software como el seguimiento microbiano (MST). Adenovirus y poliomavirus son virus ADN infectar a especies específicas de vertebrados incluyendo a los humanos y son persistentemente excreta en las heces y / o de orina en todas las áreas geográficas estudiadas. En estudios anteriores, hemos sugerido la cuantificación de los adenovirus humanos (HAdV) y poliomavirus JC (JCPyV) por PCR cuantitativa (qPCR) como un índice de contaminación fecal humana. Recientemente, se han desarrollado ensayos de PCR cuantitativa para la cuantificación específica del porcine adenovirus (PADV) y poliomavirus bovina (BPYV) como animales marcadores de contaminación fecal con la sensibilidad de copias del genoma 1.10 por tubo de ensayo. En este estudio, se presenta el procedimiento a seguir para identificar la fuente de contaminación en muestras de agua usando estas herramientas. Como ejemplo de resultados representativos, el análisis de virus en el agua subterránea presenta altos niveles de nitratos se muestra. Detección de virus en las aguas contaminadas de baja o moderada requiere la concentración de los virus por lo menos de varios litros de agua en un volumen mucho menor, un procedimiento que generalmente consta de dos etapas de concentración en serie. Este procedimiento un tanto engorroso y la variabilidad observada en la recuperación viral significativamente interferir con el procesamiento simultáneo de un gran número de muestras de agua. Con el fin de eliminar los cuellos de botella causados ​​por los procedimientos de dos pasos que hemos aplicado un protocolo de un solo paso desarrollado en Studie anteriors, y aplicable a una diversidad de matrices de agua. El procedimiento incluye: la acidificación de las muestras de agua de diez litros, floculación de la leche desnatada en polvo, sedimentación por gravedad de los materiales floculada, la recogida del precipitado y centrifugación, resuspensión del precipitado en tampón fosfato 10 ml. El concentrado viral se utiliza para la extracción de ácidos nucleicos virales y los adenovirus y poliomavirus específicos de interés se han cuantificado mediante qPCR. Alto número de muestras se podrá analizar simultáneamente con este método de concentración de bajo costo. El procedimiento se ha aplicado al análisis de las aguas de baño, agua de mar y agua de los ríos y en este estudio, se presentan los resultados de analizar muestras de agua subterránea. Este método cuantitativo de alto rendimiento es fiable, sencilla y rentable.

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Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

El estudio describe un método costo-efectivo para la identificación de la fuente de contaminación fecal / orina o la contaminación por nitratos en el agua utilizando qPCR para la cuantificación específica de los virus de ADN humano / porcino / bovino, adenovirus y poliomavirus, propuesto como herramientas de MST.

Método rentable para el Rastreo de uso microbiana específica virus humanos y animales

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

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Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Investigación

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

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The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

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Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1

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