Name: quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر كارين لورانس لمساعدتها في بناء المقطع يصف الغرفة electroporation.

<ol>
	<li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design. , (2005).</li><li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genomic regulatory systems : development and evolution. , (2001).</li><li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; signals. , (2002).</li><li>Blow, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+identification+of+weakly+conserved+heart+enhancers.">ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers.</a> Nat Genet. 42, 806-810 (2010).</li><li>Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers.">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fine-tuning+of+photoreceptor+cis-regulatory+elements+through+affinity+modulation+of+transcription+factor+binding+sites.">Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites.</a> Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).</li><li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+II.+Autoradiographic+analysis+of+cell+generation+using+tritiated+thymidine.">Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine.</a> J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).</li><li>Young, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation+in+the+retina+of+the+mouse.">Cell differentiation in the retina of the mouse.</a> Anat Rec. 212, 199-205 (1985).</li><li>Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRX+ChIP-seq+reveals+the+cis-regulatory+architecture+of+mouse+photoreceptors.">CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors.</a> Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).</li><li>Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+paired-type+and+POU+homeodomain-containing+transcription+factor+program+drives+retinal+bipolar+cell+gene+expression.">A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression.</a> J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li><li>Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pias3-dependent+SUMOylation+controls+mammalian+cone+photoreceptor+differentiation.">Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation.</a> Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يزدرع electroporation هي وسيلة بسيطة لقياس نشاط رابطة الدول المستقلة التنظيم في الشبكية الماوس النامية. بالمقارنة مع بلدان رابطة الدول المستقلة ، عن طريق تحليل تنظيمي transgenesis الماوس ، electroporation أرخص بكثير ، وتتطلب الجراء الوليد الماوس فقط ، الحمض النووي ، وأدوات تشريح ، وelectroporation / الأنسجة معدات الثقافة. كما أنها تستهلك وقتا أقل بكثير : تجربة واحدة يتطلب سوى بضع ساعات من وقت الإعداد ، وهي فترة ثقافة حوالي ثمانية أيام ، وبعد ساعات قليلة على نهاية التجربة لتصوير وتحليل البيانات. يزدرع electroporation أيضا متفوقة على تحليل الخلية التنظيمية لرابطة الدول المستقلة ، القائمة على الثقافة منذ يستخدم أنسجة الشبكية الفعلية. يتطور عادة في الشبكية تماما في يزدرع الثقافة أنها تشكل ثلاث طبقات خلوية مختلفة (الطبقة النووية الخارجي ، وطبقة داخلية النووية ، وطبقة الخلايا العقدية) ، على الرغم من فشل مبصرات لوضع شرائح الخارجي. وثمة ميزة أخرى هي أن يتم استنساخه electroporation ازدراع للغاية. ويبني نفسه في شبكية العين electroporated مختلفة ، حتى في أيام مختلفة ، والنتائج عادة في مستويات التعبير النسبي نفسه. وعلاوة على ذلك ، حيث يعتقد أن البلازميدات electroporated إلى الإبقاء episomally في النواة وليس دمجها في الصبغيات (الكروموسومات) ، فإنها لا تبدو خاضعة لتأثيرات التكامل نفس الموقع الذي يبتلي مقرون التنظيم التحليل التي أجريت في الفئران المعدلة وراثيا. يزدرع electroporation لديه العديد من القيود. أولا ، يمكن فقط الخلايا التي لا تزال في دورة الخلية transduced بكفاءة electroporation 15. في P0 ، وقضبان وغيرها في وقت لاحق من مواليد أنواع الخلايا الشبكية (خلايا القطبين ، والخلايا عديم الاستطالات ، M ller الدبقية) هي الخلية الرئيسية المستهدفة من السكان بواسطة هذه الطريقة. وقد أبلغ Electroporation من مبصرات مخروط بواسطة P0 electroporation 16 ولكن يبدو أن الكفاءة المنخفضة. والقيد الثاني هو أن الثقافة يزدرع تتجاوز اسبوعين في نتائج تشوه التدريجي لشبكية العين وبالتالي لا يوصى. إذا كان مطلوبا الكمي المروج timepoints في وقت متأخر ، ومع ذلك ، قد يتم تنفيذ في electroporation فيفو 9 ، تليها تشريح الشبكية في timepoint المطلوب ، مسطحة المتصاعدة من تشريح شبكية العين ، وتقدير كما هو موضح في الباب 9. والقيد الثالث هو أن هذا الاختبار هو فقط معتدلة الإنتاجية العالية. خلافا المقايسات القائمة على الثقافة الخلية التي يمكن اختبار المئات من يبني في تجربة واحدة ، وتقنية وصفها في هذا البروتوكول يتطلب حدا أدنى من أحد الشبكية الماوس كله في بناء. وبالتالي ، يمكن معقول فقط بضع عشرات من أن يبني electroporated في يوم واحد. التحذير واحدة إضافية فيما يتعلق الكمي للنشاط المروج باستخدام النهج الحالي هو ان هناك امكانية ل&quot;ينزف من خلال&quot; لمضان DsRed في القناة GFP ، ولا سيما عندما يعاير المروجين قوي جدا. والسبب في ذلك هو أن الطيف انبعاث DsRed التي تتداخل جزئيا من GFP. للتحايل على هذه المشكلة ، يجب استخدام الفلاتر التي تقلل من الانبعاثات الأمثل للتداخل بين الأطياف وDsRed GFP. عندما يكون هذا المرشح الأمثل مجموعات غير متوفرة ، فإن احتمال حل آخر يتمثل في استخدام البروتين الزرقاء تحول الفلورسنت (على سبيل المثال ، أو BFP CFP) بدلا من GFP.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> طبق Electroporation ، Microslide 453 </td><td> BTX جهاز هارفارد </td><td> 45-0105 </td><td> انظر القسم 1 لبروتوكول التعديلات </td></tr><tr><td> 100 ٪ سيليكون المطاط الاسمنت الحوض </td><td> Perfecto التصنيع </td><td></td><td></td></tr><tr><td> البلاستيك microtube رف </td><td> فيشر العلمية </td><td> 05-541 </td><td> ولن تستخدم إلا للتعامل مع رف </td></tr><tr><td> DREMEL أداة </td><td></td><td></td><td> لقطع التعامل مع قبالة الرف أنبوب بلاستيكي </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100X تركيز </td></tr><tr><td> الأنسولين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> I - 6634 </td><td> بالنسبة لمخزون 1000X ، resuspend في 5mg/ml في حمض الهيدروكلوريك 5mM تعقيم وتصفية - </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> 830 ECM ساحة الموجة electroporator </td><td> BTX جهاز هارفارد </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مرشحات Nuclepore </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm ، 0.2μm </td></tr><tr><td> نسيج الثقافة الحاضنة </td><td></td><td></td><td> 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 </td></tr><tr><td> coverslips الزجاج # 1.5 </td><td> فيشر العلمية </td><td> 12 - 544E </td><td> سميكة 0.16mm </td></tr><tr><td> فلوري المجهر المركب مجهز بكاميرا </td><td></td><td></td><td> وينبغي أن تكون الكاميرا أحادي اللون (على سبيل المثال ، اوركا - ER الكاميرا هاماماتسو) </td></tr><tr><td> EGFP / تعيين مرشح لDsRed مجهر مركب </td><td> صفاء شركة تكنولوجيا </td><td> 86007 </td><td> هذا bleedthrough تعيين مرشح يقلل chanenels بين الأحمر والأخضر </td></tr><tr><td> ImageJ البرمجيات </td><td> المعاهد الوطنية للصحة </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation

عوامل النسخ الجيني داخل شبكات الخليوي السيطرة على نمط spatiotemporal ومستويات التعبير عن الجينات المستهدفة من قبل ملزم لرابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم (CREs) ، قصيرة (~ 300-600 بي بي) وتمتد من الحمض النووي الجيني الذي يمكن أن تظل قطاعات المنبع والمصب ، أو في غضون والإنترونات من الجينات التي تسيطر عليها. CREs (أي القدرة على / المروجين) وعادة ما تتألف من مواقع متعددة عنقودية ملزمة لكلا تفعيل النسخي وrepressors 1-3. انهم بمثابة تكامل منطقي للمدخلات الانتاج النسخي إعطاء الوحدوي في شكل من أشكال النشاط المروج spatiotemporally دقيقة ودقيقة من الناحية الكمية. وقد اعتمدت معظم الدراسات من الثدييات مقرون التنظيم حتى الآن على transgenesis الماوس كوسيلة للمعايرة وظيفة من CREs محسن 4-5. هذا الأسلوب هو مضيعة للوقت ومكلفة ، وعلى حساب من آثار موقع الإدراج ، إلى حد كبير غير الكمية. من ناحية أخرى ، تم وضع المقايسات الكمية لجنة المساواة العرقية وظيفة الثدييات في نظم زراعة الأنسجة (، على سبيل المثال المقايسات luciferase المزدوج) ، ولكن أهميتها في الجسم الحي من هذه النتائج غالبا ما تكون غير مؤكدة. Electroporation يقدم بديلا ممتازا لtransgenesis الماوس التقليدي في أنه يسمح كل من التقييم spatiotemporal والكمي لرابطة الدول المستقلة للتنظيم النشاط في الأنسجة الحية الثدييات. وقد كان هذا الأسلوب مفيدا بشكل خاص في تحليل التنظيم رابطة الدول المستقلة في النظام العصبي المركزي ، وخاصة في قشرة الدماغ وشبكية العين 6-8. بينما electroporation الماوس شبكية العين ، سواء في الجسم الحي وفيفو السابقين ، وقد وضعت وصفه على نطاق واسع بواسطة ماتسودا وCepko 6-7،9 ، وقد وضعنا مؤخرا مقاربة بسيطة لقياس نشاط مبصرة محددة CREs في شبكية العين الماوس electroporated 10. بالنظر إلى أن كمية من الحمض النووي التي يتم تقديمها في شبكية العين بواسطة electroporation يمكن أن تختلف من تجربة إلى تجربة ، فمن الضروري أن تدرج &quot;التحكم تحميل&#39; شارك في electroporated في جميع التجارب. في هذا الصدد ، والتقنية هي مشابهة جدا لفحص وluciferase المزدوجة المستخدمة لقياس النشاط المروج في الخلايا المستزرعة. عندما يعاير مبصرة مقرون التنظيم النشاط ، تتم عادة في الفئران حديثي الولادة electroporation (يوم بعد الولادة 0 ، P0) وهو وقت الذروة انتاج قضبان 11-12. مرة واحدة أنواع الخلايا الشبكية تصبح بعد الإنقسامية ، electroporation هو أقل بكثير من الكفاءة. نظرا لارتفاع معدل الولادات في الفئران حديثي الولادة قضبان وعيدان من أن تشكل أكثر من 70 ٪ من الخلايا في شبكية العين الماوس الكبار ، وغالبية الخلايا التي يتم electroporated في P0 وقضبان. لهذا السبب ، قضيب مبصرات هي أسهل نوع من الخلايا الشبكية للدراسة عبر electroporation. تقنية وصفنا هنا هو مفيد في المقام الأول لقياس نشاط CREs مبصرة.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation at JoVE.com

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

يصف هذا البروتوكول وسيلة بسيطة وغير مكلفة لقياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم (أي محسن / المروجين) يعيشون في شبكية العين عن طريق الماوس electroporation ازدراع. موصوفة إعداد الحمض النووي ، وتشريح شبكية العين ، electroporation ، ثقافة يزدرع الشبكية ، وبعد التثبيت التحليل النوعي والكمي.

قياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم في الشبكية بواسطة الماوس Electroporation يزدرع

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

نشاط التيلوميراز في مناطق مختلفة من الدماغ ماوس: التيلوميراز غير المشعة كرر بروتوكول التضخيم (TRAP) الفحص

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

في نقل فيفو جين لخلايا شوان في العصب القوارض وركي من Electroporation لل

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

التحقيق إكسون الثدييات التجديد: في فيفو انهانسر من العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

التحديد الكمي للتوزيع غير متجانسة من البروتين متشابك في الدماغ الماوس استخدام الفلورة

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

قياس النشاط شبه الخلوي يوبيكويتين بروتياسوم في الدماغ القوارض

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...