Name: quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות קארן לורנס על עזרתה בבניית קטע המתאר של החדר electroporation.

<ol>
	<li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design. , (2005).</li><li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genomic regulatory systems : development and evolution. , (2001).</li><li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; signals. , (2002).</li><li>Blow, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+identification+of+weakly+conserved+heart+enhancers.">ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers.</a> Nat Genet. 42, 806-810 (2010).</li><li>Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers.">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fine-tuning+of+photoreceptor+cis-regulatory+elements+through+affinity+modulation+of+transcription+factor+binding+sites.">Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites.</a> Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).</li><li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+II.+Autoradiographic+analysis+of+cell+generation+using+tritiated+thymidine.">Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine.</a> J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).</li><li>Young, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation+in+the+retina+of+the+mouse.">Cell differentiation in the retina of the mouse.</a> Anat Rec. 212, 199-205 (1985).</li><li>Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRX+ChIP-seq+reveals+the+cis-regulatory+architecture+of+mouse+photoreceptors.">CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors.</a> Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).</li><li>Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+paired-type+and+POU+homeodomain-containing+transcription+factor+program+drives+retinal+bipolar+cell+gene+expression.">A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression.</a> J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li><li>Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pias3-dependent+SUMOylation+controls+mammalian+cone+photoreceptor+differentiation.">Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation.</a> Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Electroporation Explant הוא אמצעי פשוט של לכימות cis-הרגולציה פעילות ברשתית עכבר מתפתחות. בהשוואה לניתוח cis-הרגולציה transgenesis באמצעות העכבר, electroporation הוא הרבה יותר זול, המחייב גורים עכבר היילוד בלבד, DNA, כלי לנתח, electroporation ו / תרבות ציוד רקמות. הוא גם הרבה פחות זמן רב: הניסוי אחד דורש רק כמה שעות של זמן הכנה, תקופה תרבות של כשמונה ימים, ולאחר כמה שעות בסוף הניסוי הדמיה וניתוח נתונים. Electroporation Explant היא גם מעולה לניתוח תרבות מבוססי cis-הרגולציה התא מאז רקמת הרשתית בפועל הוא מנוצל. הרשתית מתפתחת בדרך כלל די explant תרבות היא יוצרת שלוש שכבות נפרדות הסלולר (שכבת הגרעין החיצונית, שכבת הגרעין הפנימי, התא שכבת הגנגליון), למרות photoreceptors להיכשל לפרט מגזרים החיצונית. יתרון נוסף הוא כי electroporation explant ניתנת לשחזור מאוד. בונה אותו electroporated לתוך הרשתית שונים, אפילו בימים שונים, בדרך כלל התוצאות באותן הרמות ביטוי יחסית. יתר על כן, מאז פלסמידים electroporated נחשבים שמרו episomally בגרעין ולא ישולבו כרומוזומים, הם אינם מופיעים להיות כפוף לאתר אותן השפעות האינטגרציה כי לבלבל cis-הרגולציה ניתוח שבוצע העכברים הטרנסגניים. Electroporation Explant יש מספר מגבלות. ראשית, התאים רק כי הם עדיין מחזור התא יכול להיות יעיל transduced ידי electroporation 15. ב P0, מוטות ושאר מאוחר יותר, יליד סוגי תאים ברשתית (תאים דו קוטבית, תאים amacrine, גליה M ller) הם אוכלוסיות תאים העיקרי ממוקד בשיטה זו. Electroporation של photoreceptors חרוט על ידי electroporation P0 דווחה 16 אך היעילות נראה נמוך. המגבלה השנייה היא תרבות explant מעבר שתי תוצאות שבועות מום הדרגתי של הרשתית ולכן אינו מומלץ. אם כימות היזם נדרש על timepoints מאוחר, לעומת זאת, ב electroporation vivo מאי 9 להתבצע, ואחריו לנתיחה רשתית ב timepoint הרצוי שטוח הרכבה של הרשתית גזור, וכימות, כמתואר בסעיף 9. המגבלה השלישית היא assay זה הוא רק בינוני תפוקה גבוהה. בניגוד לתרבות המבוססת על מבחני התא יכול לבדוק את מאות המבנים בניסוי אחד, את הטכניקה המתוארת פרוטוקול זה דורש מינימום של הרשתית עכבר אחד שלם לכל לבנות. לפיכך, רק תריסר בונה כמה סביר electroporated ביום. אזהרה אחת נוספת לגבי כימות של הפעילות באמצעות מקדם את הגישה הנוכחית היא כי קיים פוטנציאל &quot;לדמם דרך&quot; של הקרינה DsRed לתוך התעלה GFP, במיוחד כאשר assaying היזמים חזקה מאוד. הסיבה לכך היא כי ספקטרום פליטה של ​​DsRed חופף חלקית את זה של ה-GFP. כדי לעקוף בעיה זו, מסנני פליטה מותאם אמור לשמש כי למזער את החפיפה בין ספקטרלי DsRed ו-GFP. כאשר כגון מערכות סינון אופטימיזציה אינם זמינים, עוד פתרון אפשרי יהיה להשתמש חלבון כחול מוזז ניאון (למשל, BFP או CFP) במקום ה-GFP.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> צלחת electroporation, Microslide 453 </td><td> BTX הרווארד Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> ראה סעיף 1 בפרוטוקול לשינויים </td></tr><tr><td> 100% גומי סיליקון מלט אקווריום </td><td> פרפקטו ייצור </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microtube פלסטיק מתלה </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 05-541 </td><td> רק להתמודד עם מתלה ישמש </td></tr><tr><td> כלי Dremel </td><td></td><td></td><td> לחיתוך את הידית מתלה צינור פלסטיק </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100x ריכוז </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> I-6634 </td><td> עבור המניות 1000x, resuspend ב 5mg/ml ב HCl 5mm ולסנן-לעקר </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 כיכר גל electroporator </td><td> BTX הרווארד Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore מסננים </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0.2μm </td></tr><tr><td> רקמות תרבות חממה </td><td></td><td></td><td> 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> זכוכית coverslips # 1.5 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-544E </td><td> עבה 0.16mm </td></tr><tr><td> תרכובת מיקרוסקופ פלורסנט מצויד במצלמה </td><td></td><td></td><td> המצלמה צריכה להיות חד גוני (למשל, ORCA-ER מצלמה ידי Hamamatsu) </td></tr><tr><td> EGFP / להגדיר מסנן DsRed עבור מיקרוסקופ מתחם </td><td> Chroma טכנולוגיה קורפ </td><td> 86007 </td><td> זה bleedthrough להגדיר מסנן ממזער chanenels בין אדום וירוק </td></tr><tr><td> ImageJ תוכנה </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation

גורמי שעתוק בתוך רשתות גנים הסלולר לשלוט דפוס spatiotemporal ורמות הביטוי של גנים היעד שלהם באמצעות קשירה cis-הרגולציה אלמנטים (צרס), קצר (~ 300-600 נ&quot;ב) מותח של הדנ&quot;א הגנומי אשר יכול לשקר במעלה הזרם, במורד הזרם, או בתוך אינטרונים הגנים הם שולטים. צרס (כלומר, משפרי / היזמים) בדרך כלל מורכב מרובים אתרי הקישור אשכולות הן activators ו repressors תעתיק 1-3. הם משמשים אינטגרטורים הלוגי של קלט תעתיק מתן פלט יחידתי בצורה של פעילות האמרגן מדויק spatiotemporally ומדויק כמותית. רוב המחקרים של יונקים cis-תקנה עד כה הסתמכה על transgenesis העכבר כאמצעי assaying משפר את הפונקציה של צרס 4-5. טכניקה זו זמן רב, יקר, על חשבון תופעות באתר הכנסת, בעיקר לא כמותי. מצד שני, מבחני כמותיים לתפקוד Cre יונקים פותחו מערכות תרבות רקמות (למשל, מבחני בלוציפראז כפול), אבל ב vivo הרלוונטיות של תוצאות אלו היא לעיתים קרובות לא ברור. Electroporation מציע אלטרנטיבה מצוינת transgenesis העכבר המסורתי בכך שהוא מאפשר גם spatiotemporal הערכה כמותית של פעילות cis-הרגולציה רקמה חיה יונקים. טכניקה זו הייתה שימושית במיוחד בניתוח של רגולציה-cis במערכת העצבים המרכזית, בעיקר בקליפת המוח ואת רשתית 6-8. בעוד electroporation עכבר הרשתית, הן in vivo לשעבר vivo, פותחה ותיאר בהרחבה על ידי מאטסודה ו Cepko 6-7,9, פיתחנו לאחרונה גישה פשוטה לכמת את הפעילות של photoreceptor ספציפי צרס ב electroporated עכבר הרשתיות 10. בהתחשב בכך את כמות ה-DNA כי הוא הציג לתוך הרשתית על ידי electroporation יכול להשתנות מניסוי לניסוי, יש צורך לכלול &quot;טעינה מלאה&quot; שותף electroporated בניסויים בכלל. במובן זה, הטכניקה דומה מאוד assay בלוציפראז כפול המשמש לכמת פעילות הפרומוטר בתאים בתרבית. כאשר assaying photoreceptor cis-הרגולציה פעילות, electroporation מתבצעת לרוב בעכברים היילוד (יום הלידה 0, P0) המהווה את זמן הייצור מוט שיא 11-12. ברגע סוגי תאים ברשתית להיות שלאחר mitotic, electroporation הוא הרבה פחות יעיל. לנוכח שיעור גבוה של לידת מוט בעכברים הילוד לבין העובדה מוטות מהוות יותר מ 70% של תאים ברשתית עכבר מבוגר, הרוב המכריע של התאים electroporated ב P0 הן מוטות. מסיבה זו, photoreceptors מוט הם סוג הקלה תא רשתית ללמוד דרך electroporation. הטכניקה שאנו מתארים כאן הוא שימושי בעיקר עבור לכימות פעילות של צרס photoreceptor.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation at JoVE.com

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

פרוטוקול זה מתאר דרך פשוטה וזולה לכמת את הפעילות של cis-הרגולציה אלמנטים (כלומר, משפר / היזמים) לחיות הרשתיות העכבר דרך electroporation explant. הכנת ה-DNA, דיסקציה רשתית, electroporation, תרבות explant רשתית, שלאחר קיבוע ניתוח וכימות מתוארים.

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...