Name: quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00
Duration: 7 min 38 s
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लेखकों करेन लॉरेंस electroporation कक्ष के निर्माण का वर्णन अनुभाग के साथ उसकी मदद के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं.

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	<li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design. , (2005).</li><li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genomic regulatory systems : development and evolution. , (2001).</li><li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; signals. , (2002).</li><li>Blow, M. 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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Explant electroporation विकासशील माउस रेटिना में सीआईएस नियामक गतिविधि को बढ़ाता का एक सरल साधन है . सीआईएस नियामक माउस transgenesis के माध्यम से विश्लेषण की तुलना में, electroporation बहुत सस्ता है, केवल नवजात माउस पिल्ले, डीएनए, विदारक उपकरणों, और electroporation / टिशू कल्चर के उपकरण की आवश्यकता होती है. यह भी अब तक कम समय लेने: इमेजिंग और डेटा विश्लेषण के लिए प्रयोग के अंत में एक प्रयोग तैयारी के समय का केवल कुछ घंटे, के बारे में आठ दिनों की एक संस्कृति अवधि, और कुछ ही घंटों की आवश्यकता है. Explant electroporation भी सेल संस्कृति आधारित सीआईएस नियामक विश्लेषण करने के लिए बेहतर है के बाद से वास्तविक रेटिना ऊतक का उपयोग किया जाता है. रेटिना explant में काफी सामान्य रूप से विकसित संस्कृति के तीन अलग सेलुलर परत (बाहरी परत परमाणु, भीतर परमाणु परत, और नाड़ीग्रन्थि सेल परत) रूपों, हालांकि photoreceptors बाहरी क्षेत्रों विस्तृत विफल. एक और लाभ यह है कि explant electroporation अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि. अलग अलग दिनों पर भी, एक ही अलग retinas में electroporated constructs एक ही रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर में आमतौर पर परिणाम. इसके अलावा, के बाद से electroporated plasmids episomally नाभिक में बनाए रखा जाना लगा रहे हैं और क्रोमोसोम में शामिल नहीं हैं, वे एक ही एकीकरण साइट प्रभाव है कि सीआईएस विनियामक ट्रांसजेनिक चूहों में प्रदर्शन विश्लेषण भरमाना के अधीन होना नहीं दिखाई देते हैं. Explant electroporation कई सीमाएं है. सबसे पहले, केवल कोशिकाओं है कि सेल चक्र में अभी भी कुशलता से 15 electroporation द्वारा transduced किया जा सकता है. P0, छड़ और बाद में जन्मे अन्य रेटिना सेल प्रकार (द्विध्रुवी कोशिकाओं, amacrine कोशिकाओं, एम ller glia) मुख्य सेल इस विधि द्वारा लक्षित आबादी रहे हैं. P0 electroporation द्वारा शंकु photoreceptors के electroporation 16 सूचित किया गया है लेकिन दक्षता को कम प्रतीत होता है. एक दूसरी सीमा है कि रेटिना के प्रगतिशील कुरूपता में दो सप्ताह के परिणाम से परे explant संस्कृति है और इसलिए की सिफारिश नहीं है. अगर प्रमोटर मात्रा का ठहराव देर timepoints में आवश्यक है, तथापि, एक 9 electroporation vivo में प्रदर्शन किया जा सकता है बाद रेटिना विच्छेदन द्वारा वांछित timepoint, dissected रेटिना के फ्लैट बढ़ते, और मात्रा का ठहराव के रूप में धारा 9 में वर्णित है. एक तीसरा सीमा है कि इस परख केवल मामूली उच्च throughput है. सेल संस्कृति आधारित assays है कि एक ही प्रयोग में constructs के सैकड़ों का परीक्षण कर सकते हैं के विपरीत, इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक निर्माण प्रति पूरे माउस रेटिना की एक न्यूनतम आवश्यकता है. इस प्रकार, केवल एक जोड़ी दर्जन constructs यथोचित एक दिन में electroporated जा सकता है. प्रमोटर वर्तमान दृष्टिकोण का उपयोग कर गतिविधि की मात्रा का ठहराव के लिए सम्मान के साथ एक अतिरिक्त चेतावनी है कि वहाँ GFP चैनल में DsRed प्रतिदीप्ति के खून के माध्यम से &#39;के लिए, खासकर जब बहुत मजबूत प्रमोटरों परख करने की क्रिया एक संभावित है. इस के लिए कारण है कि उत्सर्जन के स्पेक्ट्रम GFP की है कि आंशिक रूप से overlaps DsRed. इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, अनुकूलित उत्सर्जन फिल्टर इस्तेमाल किया जा सकता है कि DsRed और GFP के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करना चाहिए. जब ऐसे अनुकूलित फिल्टर सेट उपलब्ध नहीं हैं, एक और संभावित समाधान GFP के एवज में एक नीली स्थानांतरित फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, BFP या CFP) का उपयोग होगा .

<table border="1"><tbody><tr><th> अभिकर्मक के नाम </th><th> कंपनी </th><th> सूचीपत्र संख्या </th><th> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </th></tr><tr><td> Electroporation पकवान, Microslide 453 </td><td> BTX हार्वर्ड उपकरण </td><td> 45-0105 </td><td> संशोधन के लिए प्रोटोकॉल एक अनुभाग देखें </td></tr><tr><td> 100% सिलिकॉन रबर मछलीघर सीमेंट </td><td> Perfecto विनिर्माण </td><td></td><td></td></tr><tr><td> प्लास्टिक microtube रैक </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 05-541 </td><td> केवल रैक संभाल इस्तेमाल किया जाएगा </td></tr><tr><td> Dremel उपकरण </td><td></td><td></td><td> प्लास्टिक ट्यूब रैक से संभाल काटने के लिए </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> / Gibco Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> / Gibco Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> / Gibco Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100X एकाग्रता </td></tr><tr><td> इंसुलिन </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> मैं-6634 </td><td> 1000x शेयर के लिए, 5mm एचसीएल और फिल्टर बाँझ में 5mg/ml पर resuspend </td></tr><tr><td> FBS </td><td> / Gibco Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> 830 electroporator स्क्वायर लहर ईसीएम </td><td> BTX हार्वर्ड उपकरण </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore फिल्टर </td><td> वाटमान </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0.2μm </td></tr><tr><td> टिशू कल्चर इनक्यूबेटर </td><td></td><td></td><td> 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 </td></tr><tr><td> # ग्लास 1.5 coverslips </td><td> फिशर साइंटिफिक </td><td> 12-544E </td><td> 0.16mm मोटी </td></tr><tr><td> प्रतिदीप्त परिसर में कैमरे के साथ सुसज्जित खुर्दबीन </td><td></td><td></td><td> कैमरा रंग का (उदाहरण के लिए, हमामात्सू द्वारा कैमरा ORCA-ईआर) होना चाहिए </td></tr><tr><td> EGFP / यौगिक सूक्ष्मदर्शी के लिए DsRed फिल्टर सेट </td><td> Chroma प्रौद्योगिकी कार्पोरेशन </td><td> 86007 </td><td> लाल और हरे रंग chanenels के बीच यह फिल्टर सेट minimizes bleedthrough </td></tr><tr><td> ImageJ सॉफ्टवेयर </td><td> एनआईएच </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

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Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

यह एक सरल और सस्ती explant electroporation के माध्यम से माउस retinas में रहने वाले सीआईएस नियामक तत्वों की गतिविधि (यानी, बढ़ाने / प्रमोटरों) यों प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. डीएनए तैयारी, रेटिना विच्छेदन, electroporation, रेटिना explant संस्कृति, और पोस्ट - निर्धारण विश्लेषण और मात्रा का ठहराव वर्णित हैं.

की गतिविधि बढ़ाता सीआईएस</emExplant electroporation> विनियामक माउस रेटिना में तत्व

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Research

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Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

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की गतिविधि बढ़ाता सीआईएस विनियामक माउस रेटिना में तत्व