Name: quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00
Duration: 7 min 38 s
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저자 electroporation 챔버의 섹션에 대해 설명 건설과 그녀의 도움 카렌 로렌스 감사하고 싶습니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Explant의 electroporation은 개발 마우스 망막에서 CIS - 규제 활동을 quantifying의 간단한 수단입니다. 마우스 transgenesis 통해 CIS - 규제 분석에 비해, electroporation은 신생아 마우스 새끼, DNA, 해부 악기, 그리고 electroporation / 조직 문화 장비를 필요로하는 많은 저렴합니다. 그것은 훨씬 적은 시간 또한 많이 소요 : 한 실험 영상 및 데이터 분석을위한 실험의 끝에 유일한 준비 시간이 몇 시간에 대한 팔일의 문화 시대, 그리고 몇 시간이 필요합니다. 실제 망막 조직이 활용되기 때문에 Explant의 electroporation은 또한 세포 문화 기반 CIS - 규제 분석 우수합니다. 망막은 explant에서 매우 일반적으로 개발 문화는 photoreceptors은 외부 세그먼트를 정교하지 있지만, 세 개의 서로 다른 세포 레이어를 (외부 핵 계층 내부 핵 층과 신경절 세포 층) 양식. 추가 장점은 explant의 electroporation 높은 재현성입니다. 심지어 다른 일에 다른 망막에 electroporated 동일한 구조, 동일한 상대 표현 수준에서 일반적으로 발생합니다. 또한, electroporated plasmids이 핵에 episomally 유지 생각하고 염색체에 포함되지 않습니다 때문에, 그들은 유전자 변형 생쥐에서 수행 CIS - 규제 분석을 현혹하는 동일한 통합 사이트 효과를 적용하지 않습니다. Explant의 electroporation 몇 가지 제한이 없습니다. 첫째, 세포주기에 여전히에만 세포가 효율적으로 electroporation 15 일까지 transduced 수 있습니다. P0에서 막대 및 기타 나중에 태어난 망막 세포 유형 (바이폴라 세포, amacrine 세포, M ller의 glia)이 방법에 의해 대상의 주요 세포 집단입니다. P0 electroporation에 의해 원뿔 photoreceptors의 Electroporation은 16을보고하지만 효율이 낮은 것으로 나타납니다되었습니다. 두 번째 제한은 망막의 진보보기 흉한 것 2 주 결과 너머 그 explant 문화이므로 권장하지 않습니다. 제 9에서 설명한대로 발기인의 부량 늦게 timepoints에 필요한 경우 단, 생체내의 electroporation 9가 원하는 timepoint에서 망막 절개로 뒤를 수행할 수 있습니다 해부하는 망막의 평면 장착하고, 부량. 세 번째 제한은이 분석은 적당히 높은 처리량있다는 것입니다. 한 실험에 구조의 수백을 테스트할 수 세포 배양 기반 assays과는 달리,이 프로토콜에 설명된 기술은 구성 당 하나의 전체를 마우스 망막의 최소 필요합니다. 따라서, 전용 핀셋으로 구성이 합리적 하루에 electroporated 수 있습니다. 현재 접근법을 사용 발기인 활동의 부량과 관련하여 한 추가 주의해야 할 점은 매우 강력한 발기인을 시금 때 특히, GFP의 채널로 DsRed 형광의 &#39;출혈을 통한&#39;에 대한 가능성이있다는 것입니다. 그 이유는의 방출 스펙트럼 그 GFP의 일부 중복을 DsRed 것입니다. 이 문제를 회피하기 위해 최적화된 방출 필터는 DsRed와 GFP 사이의 스펙트럼 중복을 최소화 것을 사용해야합니다. 이러한 최적화된 필터 설정을 사용할 수없는 경우, 다른 잠재적인 솔루션은 GFP 대신 푸른 이동 형광 단백질 (예, BFP 또는 CFP)를 사용하는 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> Electroporation 요리, Microslide 453 </td><td> BTX 하버드 장치 </td><td> 45-0105 </td><td> 수정에 대한 프로토콜 섹션 1을 참조 </td></tr><tr><td> 100 % 실리콘 고무 수족관 시멘트 </td><td> 퍼펙토 제조 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 microtube 걸이 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 05-541 </td><td> 전용 랙 손잡이가 사용됩니다 </td></tr><tr><td> Dremel 도구 </td><td></td><td></td><td> 플라스틱 튜브 대뿐이야 핸들을 절단 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11,965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11,765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100X 농도 </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> I - 6634 </td><td> 1000X 주식, 5mM HCL 및 필터 - 소독의 5mg/ml에 resuspend </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 스퀘어 - 웨이브 electroporator </td><td> BTX 하버드 장치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore 필터 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0.2μm </td></tr><tr><td> 조직 문화의 인큐베이터 </td><td></td><td></td><td> 37 ° C 5 % CO 2 </td></tr><tr><td> 유리 coverslips # 1.5 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 12 - 544E </td><td> 두께 0.16mm </td></tr><tr><td> 카메라가 장착된 형광등 복합 현미경 </td><td></td><td></td><td> 카메라 단색 (하마 마츠에 의해 예, 오르카 - ER 카메라)되어야합니다 </td></tr><tr><td> EGFP / 복합 현미경에 대한 DsRed 필터 세트 </td><td> 채도 기술 주식 회사 </td><td> 86,007 </td><td> 빨간색과 초록색 chanenels 사이에이 필터 세트 최소화 bleedthrough </td></tr><tr><td> ImageJ 소프트웨어 </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation

세포 유전자 네트워크 내에서 전사 요소 짧은 CIS - 규제 요소 (CRES)에 바인딩하여 spatiotemporal 패턴과 목표 유전자의 표현 수준을 제어 (~ 300-600 BP) 상류 거짓말을 할 수 게놈의 DNA 뻗어, 하류, 또는 시간 그들이 제어 유전자의 introns. 크르 (즉, 강화 / 발기인)은 일반적으로 1-3 transcriptional activators 및 repressors 모두에 대해 여러 개의 클러스터 바인딩 사이트로 이루어져 있습니다. 그들은 transcriptional 입력 논리적으로 통합이 spatiotemporally 정확하고 양적 정확한 발기인 활동의 형태로 하나의 출력을 제공 역할을합니다. 최신 CIS 규제 포유류의 대부분의 연구 4-5 CRES의 확장기 기능을 시금의 수단으로 마우스 transgenesis에 의존합니다. 이 기술은 주로 비 양적, 삽입 사이트 효과를 계정에 시간이 걸리는 비용과입니다. 한편, 포유 동물 CRE 기능에 대한 정량 assays는 조직 문화 시스템 (예를 들어, 듀얼 루시페라제 assays)에서 개발하지만, 이러한 결과의 생체내 관련성에서 종종 확실치되었습니다. Electroporation은 포유류의 조직 생활에서 CIS - 규제 활동 spatiotemporal와 양적 평가 모두를 허용한다는 점에서 전통적인 마우스 transgenesis에 훌륭한 대안을 제공합니다. 이 기술은 특히 대뇌 피질과 망막 6-8에서, 중추 신경 시스템에서 CIS 규제의 분석에 특히 유용했습니다. 생체내 및 전직 생체내 마우스 모두에서 망막 electroporation은, 개발 광범위하게 쓰다 및 Cepko 6-7,9에 의해 설명하고있는 동안, 우리는 최근 electroporated 마우스 망막 10 photoreceptor 특정 CRES의 활동을 계량하는 간단한 방법을 개발했습니다. electroporation에 의해 망막에 도입 DNA의 양이 실험에서 실험에 따라 다를 수 있습니다 감안할 때, 그것은 모든 실험에서 공동 electroporated &#39;로딩 제어&#39;를 포함하는 것이 필요합니다. 이러한 측면에서 기술 교양 세포에서 발기인 활동을 계량하는 데 사용되는 듀얼 루시페라제 분석과 매우 비슷합니다. photoreceptor CIS - 규제 활동을 시금 때, electroporation은 일반적으로 최고 막대 생산 11-12의 시간 신생아 생쥐 (출생 후의 일 0, P0)에서 수행됩니다. 일단 망막 세포 유형 사후 mitotic되고, electroporation들은 훨씬 더 효율적입니다. 신생아 마우스 및 막대는 성인 마우스 망막에있는 세포의 이상이 70 %를 구성한다는 사실에 막대의 출생의 높은 비율을 감안할 때, P0에서 electroporated 아르 세포의 대부분은 막대합니다. 이러한 이유로, 막대의 photoreceptors은 electroporation을 통해 공부하는 가장 쉬운 망막 세포 유형입니다. 우리가 여기서 설명하는 기술은 photoreceptor 크르의 활동을 quantifying 주로 유용합니다.

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Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

이 프로토콜은 explant의 electroporation을 통해 마우스 망막 생활 CIS - 규제 요소의 활동 (즉, 확장기 / 발기인)를 수치 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. DNA의 준비, 망막 절개, electroporation, 망막 explant의 문화, 포스트 고정 분석과 부량이 설명되어 있습니다.

의 활동을 Quantifying CIS</emExplant Electroporation하여 마우스 망막에서> - 규제 요소

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

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The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

의 활동을 Quantifying CIS - 규제 요소