Name: quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Карен Лоуренс за помощь в раздел, описывающий строительство электропорации камеры.

<ol>
	<li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design. , (2005).</li><li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genomic regulatory systems : development and evolution. , (2001).</li><li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; signals. , (2002).</li><li>Blow, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+identification+of+weakly+conserved+heart+enhancers.">ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers.</a> Nat Genet. 42, 806-810 (2010).</li><li>Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers.">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fine-tuning+of+photoreceptor+cis-regulatory+elements+through+affinity+modulation+of+transcription+factor+binding+sites.">Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites.</a> Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).</li><li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+II.+Autoradiographic+analysis+of+cell+generation+using+tritiated+thymidine.">Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine.</a> J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).</li><li>Young, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+differentiation+in+the+retina+of+the+mouse.">Cell differentiation in the retina of the mouse.</a> Anat Rec. 212, 199-205 (1985).</li><li>Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRX+ChIP-seq+reveals+the+cis-regulatory+architecture+of+mouse+photoreceptors.">CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors.</a> Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).</li><li>Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+paired-type+and+POU+homeodomain-containing+transcription+factor+program+drives+retinal+bipolar+cell+gene+expression.">A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression.</a> J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li><li>Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pias3-dependent+SUMOylation+controls+mammalian+cone+photoreceptor+differentiation.">Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation.</a> Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Эксплантов электропорации это простое средство количественной цис-регуляторных активности в развивающихся мыши сетчатки. По сравнению с цис-регуляторных анализа с помощью мыши трансгенез, электропорации намного дешевле, требуя только новорожденные мыши щенков, ДНК, рассекающих инструментов и электропорации / оборудование тканевой культуры. Это также намного меньше времени: один эксперимент требует всего несколько часов на подготовку, культуру течение примерно восьми дней, и через несколько часов в конце эксперимента по визуализации и анализа данных. Эксплантов электропорации также превосходит культуре клеток основе цис-регуляторных анализа, так как фактические ткани сетчатки используется. Сетчатка развивается вполне нормально в эксплантов культуры она образует три различных клеточных слоев (наружный ядерный слой, внутренний ядерный слой, и слой ганглиозных клеток), хотя фоторецепторы не в состоянии разработки наружных сегментах. Еще одним преимуществом является то, что эксплантов электропорации очень воспроизводимые. Же конструкции электропорации в различные сетчатки, даже в разные дни, как правило, приводит к тому же относительные уровни выражения. Кроме того, поскольку электропорации плазмид, как считается, поддерживаются episomally в ядре и не включены в хромосомы, они, кажется, не подлежат же интеграция сайта эффектов, захлестнувшие цис-регуляторных анализ, проведенный в трансгенных мышей. Эксплантов электропорации имеет несколько ограничений. Во-первых, только клетки, которые все еще ​​находятся в клеточном цикле может быть эффективно трансдуцированных электропорацией 15. При Р0, прутки и другие, более поздние происхождения типов клеток сетчатки (биполярные клетки, клетки amacrine, М Мюллер глии) являются основными клеточных популяций целевых этим методом. Электропорация конуса фоторецепторов через P0 электропорации сообщалось 16, но эффективность оказывается низким. Вторым ограничением является то, что эксплантов культуры за две недели приводит к прогрессивной порок развития сетчатки, и поэтому не рекомендуется. Если промоутер количественного требуется в конце timepoints, однако, в естественных условиях электропорации 9 может быть выполнена, после вскрытия сетчатки в нужное timepoint, телевизор с плоским монтаж расчлененный сетчатки, и количественное, как описано в разделе 9. Третье ограничение, что этот анализ является лишь умеренно высокой пропускной способностью. В отличие от культуры клеток основе анализов, которые могут проверить сотни конструкций в одном эксперименте, техника, описанная в данном протоколе требует как минимум одного целого сетчатке мышей в конструкцию. Таким образом, только пару десятков конструкций может быть разумно электропорации в день. Еще один нюанс в отношении количественного промоутер деятельности с использованием данного подхода является то, что есть потенциал для &#39;проступание&#39; из DsRed флуоресценцию в канал GFP, в частности, когда опробование очень сильные промоутеры. Причиной этого является то, что спектр излучения DsRed частично перекрывается у GFP. Чтобы обойти эту проблему, оптимизированные фильтры выбросов должны быть использованы, которые минимизируют спектрального перекрытия между DsRed и GFP. Когда такие оптимизированные наборы фильтров нет, еще одним потенциальным решением было бы использовать сине-смещается флуоресцентный белок (например, БПС или CFP) вместо GFP.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии (необязательно) </th></tr><tr><td> Электропорация блюдо, предметное стекло 453 </td><td> BTX Гарвардского аппарата </td><td> 45-0105 </td><td> См. раздел 1 протокола о внесении изменений </td></tr><tr><td> 100% силиконовый каучук аквариуме цемента </td><td> Производство Perfecto </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Пластиковые стойки микропробирок </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Только стойку дескриптор будет использоваться </td></tr><tr><td> Dremel инструмент </td><td></td><td></td><td> Для резки ручка с пластиковой стойке трубки </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100X концентрации </td></tr><tr><td> Инсулин </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> Для 1000X акций, ресуспендируют в 5mg/ml в 5 мМ HCl и фильтр-стерилизовать </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Прямоугольные electroporator </td><td> BTX Гарвардского аппарата </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore фильтры </td><td> Ватман </td><td> 110606 </td><td> 25 мм, 0,2 мкм </td></tr><tr><td> Культуры ткани инкубатор </td><td></td><td></td><td> 37 ° C, 5% СО 2 </td></tr><tr><td> Стекла покровные № 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> 0,16 мм толстых </td></tr><tr><td> Флуоресцентный микроскоп соединения оснащен камерой </td><td></td><td></td><td> Камера должна быть монохроматическим (например, ORCA-ER камеру, Хамамацу) </td></tr><tr><td> EGFP / DsRed набор фильтров для соединения микроскоп </td><td> Chroma технологий корпорации </td><td> 86007 </td><td> Это набор фильтров минимизирует bleedthrough между красным и зеленым chanenels </td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantifying the activity of cis-regulatory elements in the mouse retina by explant electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation at JoVE.com

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Этот протокол описывает простой и недорогой способ для количественной оценки активности цис-регуляторных элементов (например, усилитель / промоутеров) в живой мыши сетчатки через эксплантов электропорации. Препарата ДНК, сетчатке глаза рассечение, электропорация, сетчатки культуры эксплантов, и после фиксации анализ и количественное описаны.

Количественная активность СНГ-Регуляторных элементов в мышь Retina от эксплантов Электропорация

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

В естественных условиях Электропорация развивающихся Мышь Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Перенос генов в разработке мыши Внутреннее ухо по<em&gt; В Vivo</em&gt; Электропорация

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Оценка сосудистой регенерации в ЦНС Использование мыши Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Активности теломеразы в различных регионах мозга мыши: нерадиоактивный теломеразы повторить Amplification протокол (TRAP) Анализ

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Са изображений<sup&gt; 2+</sup&gt; Динамика колбочек аксонов мыши Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

В естественных условиях переноса гена к шванновских клеток в нерве Грызун седалищного путем электропорации

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Следственный млекопитающих Axon регенерации: В Vivo электропорации взрослых мыши Спинной корень ганглия

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Количественная оценка гетерогенных распределение синаптических белков в мозг мыши, с помощью иммунофлюоресценции

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Количественная подклеточная убиквитин-протеасомная активность в мозге грызунов

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...