Name: mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination
Uploaded: 2011-08-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door een RO1 subsidie ​​van NIH (NINDS).

1. Voorbereiden virussen voor injectie <ol><li> rAAVs werden gekocht bij de aanbevolen commerciële leverancier, maar ze kunnen ook worden geproduceerd in het eigen lab (zie bespreking hieronder). Het virus oplossing is meestal geproduceerd in een titer van ~ 1x10 12 exemplaren van het genoom per milliliter (GC / ml) en kan gebruikt worden op volle titer van een groot aantal van de cellen te manipuleren. Als alternatief kunnen zij worden verdund tot het gewenste niveau van schaars etikettering te produceren...

<ol>
	<li>Geschwind, D. H., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders:+developmental+disconnection+syndromes.">Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).</li><li>Giedd, J. N., Rapoport, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+MRI+of+pediatric+brain+development:+what+have+we+learned+and+where+are+we+going?.">Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?.</a> Neuron. 67, 728-734 (2010).</li><li>Chedotal, A., Richards, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+brain:+the+biology+of+neuronal+guidance.">Wiring the brain: the biology of neuronal guidance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Shen, K., Cowan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+molecules+in+synapse+formation+and+plasticity.">Guidance molecules in synapse formation and plasticity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Chen, S. Y., Cheng, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+axon+guidance+molecules+in+synapse+formation.">Functions of axon guidance molecules in synapse formation.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).</li><li>Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+current+large-scale+mouse+knockout+efforts.">A review of current large-scale mouse knockout efforts.</a> Genesis. 48, 73-85 (2010).</li><li>Tenenbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV-mediated+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system.</a> J Gene Med. 6, 212-222 (2004).</li><li>Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain.">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li><li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Szulc, J., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+expression+and+knockdown+using+lentivirus+vectors+encoding+shRNA.">Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA.</a> Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-701 (1999).</li><li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).</li><li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

De neonatale virale injectiemethode hier wordt gepresenteerd biedt een eenvoudige en snelle manier voor het genereren van in vivo mozaïeken voor de studie van postnatale ontwikkeling van de hersenen. De methode maakt gebruik van floxed allelen die momenteel beschikbaar zijn en als die worden gedaan via de High Throughput Gene Targeting project 6. In vergelijking met het gebruik van transgene expressie van Cre, deze methode biedt een snelle manier om genfunctie in verschillende celtypen te testen, al...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre,-GFP,-DsRed, </td><td> Vector Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, custom order </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard Pomp 11 Plus </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> # 702208 </td><td> (Geen voetpedaal-poort) </td></tr><tr><td> Retinale pigmentepitheel Injection Kit </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> RPE-KIT </td><td> Bevat verbindende slang, injectienaalden (36g), en naaldhouder </td></tr><tr><td> NanoFil Spuit, 100μl </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> NANOFIL-100 </td><td> Inclusief herbruikbare het laden van de naald </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP antilichaam </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRed antilichaam </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> Verwarming Block </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R muis </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

Een normale hersenfunctie vertrouwt niet alleen op de embryonale ontwikkeling als de belangrijkste neuronale paden zijn gevestigd, maar ook op de postnatale ontwikkeling bij het neurale circuits zijn gerijpt en verfijnd. Misregulation in dit stadium kan leiden tot neurologische en psychiatrische aandoeningen zoals autisme en schizofrenie 1,2. Veel genen zijn onderzocht in de prenatale hersenen en vond cruciaal belang voor vele ontwikkelingsprocessen 3-5. Echter, hun functie in de postnatale hersenen is grotendeels onbekend, mede omdat hun verwijdering in muizen leidt vaak tot sterfte tijdens de neonatale ontwikkeling, en deels omdat hun eis in de vroege ontwikkeling belemmert de postnatale analyse. Om deze obstakels, worden floxed allelen van deze genen op dit moment geproduceerd in muizen 6. In combinatie met transgene allelen die uitdrukken Cre recombinase in specifieke celtypen, voorwaardelijke verwijdering kan worden bereikt om gen-functie in de postnatale hersenen te bestuderen. Echter, deze methode vereist bijkomende allelen en extra tijd (3-6 maanden) voor het genereren van de muizen met de juiste genotypen, waardoor het beperken van de uitbreiding van de genetische analyse van een grote schaal in de hersenen van muizen. Hier laten we zien een complementaire aanpak die viraal geuit Cre gebruikt om deze floxed allelen bestuderen snel en systematisch in postnatale ontwikkeling van de hersenen. Door het injecteren van recombinant adeno-geassocieerde virussen (rAAVs) 7,8 codering Cre in de neonatale hersenen, we zijn in staat om het gen van interesse in de verschillende gebieden van de hersenen te verwijderen. Door het beheersen van de virale titer en coexpressing een fluorescerend eiwit marker, kunnen we tegelijkertijd realiseren mozaïek-gen inactivatie en spaarzame neuronale etikettering. Deze methode omzeilt de eis van vele genen in de vroege ontwikkeling, en stelt ons in staat om te studeren hun cel autonome functie in een groot aantal kritische processen in de postnatale ontwikkeling van de hersenen, waaronder axonale en dendritische groei, vertakkingen, en tegels, maar ook synapsvorming en verfijning. Deze methode is met succes gebruikt in onze eigen lab (niet gepubliceerde resultaten) en anderen 8,9, en kan worden uitgebreid tot andere virussen, zoals lentivirus 9, evenals voor de uitdrukking van shRNA of dominante actieve eiwitten 10. Bovendien, door het combineren van deze techniek met de elektrofysiologie, alsook recent ontwikkelde optische beeldvorming tools 11, deze methode zorgt voor een nieuwe strategie om te onderzoeken hoe genetische pathways invloed neurale circuit de ontwikkeling en functie in muizen en ratten.

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination at JoVE.com

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Een<em&gt; In vivo</em&gt; Methode om gen-functie te testen in postnatale hersenen wordt beschreven. Recombinant AAVs uiten Cre-en / of een fluorescerend eiwit wordt geïnjecteerd in neonatale hersenen van muizen. Mozaïek gen inactivatie en schaars neuronale etikettering worden bereikt, waardoor een snelle analyse van de genfunctie in processen van cruciaal belang voor neurale circuit ontwikkeling.

Mozaïek Analyse van Gene Functie in Postnatale Mouse ontwikkeling van de hersenen met behulp van Virus-based Cre recombinatie

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Gene Levering aan Postnatale Rat Brain door niet-ventriculaire Plasmide-injectie en elektroporatie

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic transplantatie van Interneuron precursoren in vroege postnatale muis hersenen

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Bestuderen van de hersenfunctie bij kinderen met behulp van Liquor

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Chronische implantatie van geheel-corticale Electrocorticographic Array in de gemeenschappelijke Hapalomys

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...