Name: mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination
Uploaded: 2011-08-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination at JoVE.com

Detta arbete stöds av en RO1 anslag från NIH (NINDS).

1. Förbereda virus för injektion <ol><li> rAAVs köptes från den rekommenderade kommersiell leverantör, men de kan också framställas i sitt eget laboratorium (se nedan). Viruset Lösningen är normalt produceras i en titer på ~ 1x10 12 genomet kopior per milliliter (GC / ml) och kan användas på full titer att manipulera ett stort antal celler. Alternativt kan spädas för att producera önskad nivå av glesa märkning. Den tillämpliga utspädningen måste bestämmas av användaren, men en 1:10 sp?...

<ol>
	<li>Geschwind, D. H., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders:+developmental+disconnection+syndromes.">Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).</li><li>Giedd, J. N., Rapoport, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+MRI+of+pediatric+brain+development:+what+have+we+learned+and+where+are+we+going?.">Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?.</a> Neuron. 67, 728-734 (2010).</li><li>Chedotal, A., Richards, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+brain:+the+biology+of+neuronal+guidance.">Wiring the brain: the biology of neuronal guidance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Shen, K., Cowan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+molecules+in+synapse+formation+and+plasticity.">Guidance molecules in synapse formation and plasticity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Chen, S. Y., Cheng, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+axon+guidance+molecules+in+synapse+formation.">Functions of axon guidance molecules in synapse formation.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).</li><li>Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+current+large-scale+mouse+knockout+efforts.">A review of current large-scale mouse knockout efforts.</a> Genesis. 48, 73-85 (2010).</li><li>Tenenbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV-mediated+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system.</a> J Gene Med. 6, 212-222 (2004).</li><li>Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain.">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li><li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Szulc, J., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+expression+and+knockdown+using+lentivirus+vectors+encoding+shRNA.">Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA.</a> Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-701 (1999).</li><li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).</li><li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

Den neonatala virala injektion metod som presenteras här ger ett enkelt och snabbt sätt att generera in vivo mosaiker för studier av postnatal hjärnans utveckling. Metoden drar nytta av floxed alleler som är tillgängliga samt de som görs genom den höge genomströmning riktad genmodifiering projektet 6. Jämfört med användningen av transgena uttryck för CRE, ger denna metod ett snabbt sätt att testa geners funktion i olika celltyper, som möss bär floxed alleler kan användas direkt för ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (frivilligt) </th></tr><tr><td> rAAV8-CRE,-GFP,-DsRed, </td><td> Vector Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, anpassad ordning </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard Pump 11 Plus </td><td> Harvard Apparatus </td><td> # 702.208 </td><td> (Inga fotpedal port) </td></tr><tr><td> Pigmentepitelet Injection Kit </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> RPE-KIT </td><td> Innehåller bindväv slangar, kanyler (36g) och nål </td></tr><tr><td> NanoFil spruta, 100μl </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> NANOFIL-100 </td><td> Inkluderar återanvändbara lastning nål </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP antikropp </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRed antikropp </td><td> Clontech </td><td> 632.496 </td><td></td></tr><tr><td> Värmeblock </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R mus </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 003.309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

Hjärnans normala funktion är beroende inte bara på embryonal utveckling när stora neuronala banor är etablerade, men också på postnatal utveckling när neurala kretsar är mognat och förfinats. Misregulation i detta skede kan leda till neurologiska och psykiatriska sjukdomar som autism och schizofreni 1,2. Många gener har studerats i prenatal hjärnan och funnit avgörande betydelse för många utvecklingsprocesser 3-5. Dock är deras funktion i den postnatala hjärnan i stort sett okända, dels för att de raderas på möss ofta leder till dödlighet under neonatal utveckling, dels därför att deras krav i tidiga utveckling hämmar den postnatala analysen. För att övervinna dessa hinder är floxed alleler av dessa gener för närvarande genereras i möss 6. I kombination med transgena alleler som uttrycker Cre recombinase i specifika celltyper kan villkorliga radering uppnås för att studera geners funktion i den postnatala hjärnan. Detta kräver dock att metoden ytterligare alleler och extra tid (3-6 månader) för att generera möss med lämpliga genotyper, vilket begränsar utbyggnaden av genetisk analys för att i stor skala i musen hjärnan. Här visar vi en kompletterande strategi som använder viralt-uttryckta Cre att studera dessa floxed alleler snabbt och systematiskt i postnatala hjärnans utveckling. Genom att injicera rekombinant Adeno-associerad virus (rAAVs) 7,8 kodning Cre i neonatal hjärnan kan vi ta bort genen av intresse i olika regioner av hjärnan. Genom att kontrollera virus titer och coexpressing ett fluorescerande protein markör, kan vi uppnå samtidigt inaktivering mosaik gen och gles neuronala märkning. Denna metod kringgår kravet på många gener i tidig utveckling och ger oss möjlighet att studera deras cell självständig funktion i många viktiga processer i postnatala hjärnans utveckling, inklusive axonal och dendritiska tillväxt, förgrening och plattsättning samt synaps bildning och förfining. Denna metod har använts framgångsrikt i vårt eget labb (opublicerade resultat) och andra 8,9, och kan utvidgas till andra virus, såsom lentivirus 9, samt ett uttryck för shRNA eller dominerande aktiva proteiner 10. Genom att kombinera denna teknik med elektrofysiologi samt nyligen utvecklade optisk bildframställning 11, ger denna metod en ny strategi för att studera hur genetiska vägar att påverka neural krets utveckling och funktion hos möss och råttor.

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination at JoVE.com

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

En<em&gt; In vivo</em&gt; Metod för att testa geners funktion i postnatal hjärnan beskrivs. Rekombinant AAVs uttrycka Cre och / eller en fluorescerande proteinet injiceras i neonatal musen hjärnan. Mosaic gen inaktivering och glesa neuronala märkning uppnås, så en snabb analys av geners funktion i processer viktiga för neurala kretsen utveckling.

Mosaik analys av geners funktion i Postnatal mus hjärnans utveckling med hjälp av Virus-baserade Cre Rekombination

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Gene Leverans till Postnatal råtthjärna av icke-ventrikulär Plasmid Injection och elektroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mus I livmodern Elektroporation: Kontrollerad Spatiotemporal Gene Transfektion

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

I ovo elektroporering i Chick mitthjärnan för att studera genfunktion av dopaminerg Neuron utveckling

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerga Fibrer i ryggmärgen hos möss med hjälp av CLARITY / CUBIC teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Inducerande Cre-lox rekombination i mus hjärnbarken genom In Utero elektroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Homochronic Transplantation av Interneuron prekursorer i tidig Postnatal mus hjärnor

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Studera hjärnans funktion i barn som använder Magnetencefalografi

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, rening och kvalitetskontroll för Adeno-associerade Virus-baserat vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Kronisk Implantation av hela-kortikala Electrocorticographic matris i Marmosettapa

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Transplantation av Chemogenetiskt konstruerade kortikala Interneuron progenitorer till tidiga postnatal mus hjärnor

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...