אנו מודים Dibbits ברט לקבלת סיוע טכני. גידול בעלי חיים קבוצה Genomics, אוניברסיטת Wageningen, הולנד, אירח אותנו בנדיבות במעבדה שלהם. צוות של ציפור Ottenby המצפה, שבדיה, הוא הודה על השמנה הדגימה ברכיות, בפרט Hellström מגנוס, מרקוס דניאלסון, כריסטופר מגנוסון ו סטינה אנדרסון. אנו מודים וסאנה Svensson, יונתן Qvist ו Per-אקסל Gjöres לצילום בבית Ottenby ו מנו Camon לצילום במעבדה. דניאל Bengtson סיפק תמונות ברווז יפה עבור חלק הווידאו של פרסום זה. חומר נוסף חינם מן הספרייה הציבורית של ה-CDC הבריאות תמונה (פיל; <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a> ) שימש: מיקרוסקופ אלקטרונים (מס &#39;280, על ידי ד&quot;ר ארסקין פאלמר) ואיור (מס&#39; 11823; על ידי דאגלס ירדן) של נגיף השפעת. תמיכה כספית ניתנה על ידי KNJV (רויאל הולנד ציידים האגודה), משרד הולנדית החקלאות, Faunafonds ואת דה Stichting Eik נאמנויות (הן הולנד), השוודית המועצה למחקר (לא מענק. 2007-20774) ואת EC מבוסס Newflubird הפרויקט. כימיקלים RNA הבידוד היו מתנה נדיבה של Ambion, Inc, חברת RNA. זוהי תרומה מס &#39;245 של בירד Ottenby המצפה.

1. ברווז השמנה סחיטה ביוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלכודת שכשוך ברווזים של אנס הסוג (או ציפורים אחרות) בכלוב ידי משיכת אותם עם ברווזים לפתות או מזון, והכניס אותם לתוך קופסאות לוח הפרט כרטיס. זמן תחבורה בתיבת צריכה להיות מינימלית, למשל, על ידי התקנת תחנת השדה במרחק קצר אל המלכודת. בנסיבות לוגיסטיים עשויים להשתנות במחקר זה. העצה ואישור של החיה הרלוונטית ועדת האתיקה צריכה להיות חיפשו כל חדש הגדרת. לחלופין, גם צייד הציפורים נורו ניתן שנדגמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הברווז של התיבה על ידי החזקת כנפיו הדוקה לגוף שלה. לדוגמא הטלת טרי, אשר יהיה נוכח ברוב המקרים, ישירות מהחלק התחתון של התיבה. לאסוף אותם עם ספוגית סטרילית וליישם את נוזל לכרטיס Whatman FTA. אם לא, לבצע שטיפת ביוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הברווז על גבו. זה מאפשר גישה אל הביב ומקל הדגימה. הביב הוא מבנה בולט ממוקם מתחת בבטן, קרוב לבסיס הזנב. אדם מנוסה יכול להחזיק המדגם ציפור באותו זמן, או אחר אדם נוסף יכול לסייע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס פלסטיק סטרילית זהורית ספוגית (קופאן, איטליה) כ 1 ס&quot;מ וליצור מערבולת עדינה של הביב. מגלגלים את ספוגית עם הנוזלים מן הביב על פני השטח של כרטיס Whatman FTA. שחרור מיידי לאחר שבוצעה דגימה של החיה רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הקלפים FTA בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות 1, אז כל חנות בנפרד מדגם בשקיות נייר (מעטפות, לדוגמה). אחסון אפשרי בטמפרטורת החדר, אולי עם חרוזי סיליקה באקלים לח. שליחה וקבלה של biosafety &quot;מוסדות קצינים יכולים להרשות לשלוח כרטיסי FTA בדואר רגיל, שכן פתוגנים הופכים פעיל במגע עם המשטח כרטיס FTA. </li></ol> 2. בידוד נגיפי RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את החומר כרטיס FTA כולל צואה / נוזל ביוב. Punch שלוש דיסקיות עם אגרופן האריס 2 מ&quot;מ במקום כל אלה לתוך באר של צלחת חינם 96well RNase. בין כל דגימה חדשה, לנקות את אגרופן בזהירות עם אלכוהול דיוק קים לנגב (Kimtech). השתמש תמיד שולט חיוביים ושליליים. פקד חיובית יכולה להיות מורכבת זן מעבדה להחיל טרי לכרטיס FTA, או מדגם טבעי שהוא יודע להניב תוצאה חיובית. כפי בקרה שלילית, אגרוף החוצה דיסקים מכרטיס FTA ריק. בנוסף, לעזוב נוסף חינם גם עבור פקד ה-PCR בהמשך הניסוי שלך (עם המים כתבנית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 70μl RNA פתרון מהיר החילוץ (Ambion) וחום חותם את הצלחת (AbGene Thermo-אוטם). דגירה 5 דקות על שייקר צלחת בטמפרטורת החדר במהירות נקבע כי אינו גורם לשפוך מעל (זה תלוי את המודל המשמש צלחת שייקר; בדיקה מראש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Carry ויראלי בידוד RNA על פי פרוטוקולים של היצרן עם MagMAX-96 נגיפי RNA ערכת בידוד (Ambion). בקיצור: הוסף 130μl מוכן תמוגה / פתרון מחייב (מ בערכה) היטב כל אחד. העברת 50μl חילוץ חומר FTA כרטיס היטב כל אחד. Shake צלחת דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20μl לערבב חרוז מוכן (מ בערכה) לדגום כל ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה. תלחצו על מהירות נחוש במשך 5 דקות. מולקולות רנ&quot;א יהיה לאגד את חרוזים מגנטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את צלחת מגנטי 96-היטב לעמוד כדי ללכוד את החרוזים. בהתאם לדגם של מעמד מגנטי בשימוש, זה יכול לקחת יותר מ 5 דקות. כאשר הפתרון הפך ברור לחלוטין, להסיר ולסלק supernatant. ואז להסיר את צלחת מדוכן מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים פעמיים עם פתרון לרחוץ 1 ופעמיים עם פתרון לשטוף 2 (מ בערכה). עבור כל אחד 4 שלבים לשטוף להוסיף לשטוף 150μl פתרון מוכן מדגם זה, ללחוץ במשך דקה 1 על מהירות נחוש, לעבור את הצלחת לעמוד המגנטי, ללכוד חרוזים כ -5 דקות (או עד הפתרון הוא ברור לחלוטין), הסר להשליך את supernatant. ואז להסיר את צלחת מדוכן מגנטי, להוסיף את הפתרון לשטוף הבא, ולבצע את הצעדים כביסה כמו בעבר. לאחר שלב הכביסה האחרון, להסיר פתרון לשטוף כמה שיותר אוויר יבש החרוזים בטמפרטורת החדר ב שייקר צלחת במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μl של חיץ elution (מ בערכה) לשחרר RNA מן החרוזים ולנער במשך 4 דקות על שייקר צלחת. לכידת חרוזים כפי שתואר לעיל. Supernatant כרגע המכיל את הרנ&quot;א מבודדים אשר מוכן יישומים במורד הזרם. </li></ol> 3. RT-PCR של מטריקס AIV ג&#39;ין ביצוע PCR שעתוק הפוך (RT-PCR) עם One-Step RT-PCR גישה למערכת (Promega) ב 25 תגובות μl (מנוכה מן קראוס ואח&#39; 18 ו Fouchier ואח&#39; 22..): <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Nuclease מים חינם </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 חיץ </td&gt; <td> 5μl </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> פריימר M52C 22 (10 מיקרומטר) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> פריימר M253R 22 (10 מיקרומטר) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 מ&quot;מ) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV הפוך transcriptase (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> פולימראז TFL (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> רנ&quot;א מדגם </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> תנאי ה-PCR ב T1 Biometra thermocycler הם: שעתוק לאחור הראשונית של 45 דקות 45 ° C, ואחריו denaturation 2 דקות הראשונית ב 94 ° C ו 40 מחזורים של: 94 ° C עבור 1 דקה, 56 ° C למשך דקה 1, 68 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. התארכות נוסף 7 דקות 68 ° C מסכם את ההגברה. 4. הקרנת עבור AI חיובי דוגמאות וטיהור של קטעים מתוך ממוקד ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 2μl של המוצר PCR מעורבב עם צבע 2μl טעינת 5x (BioRad) ומים 6μl על 1% agarose ג&#39;ל (Roche) מוכתם ברומיד ethidium 1% (2.5μl לכל ג&#39;ל מ&quot;ל 100) להקרנה מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרץ את הג&#39;ל שעה 1 ב 120V, יחד עם תקן ה-DNA גודל (עומס BioRad EZ 100 סולם bp), לדמיין עם מערכת תיעוד ג&#39;ל. ראה דוגמה באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר דגימות עם שברי מוגבר בטווח גודל הצפוי (בין 200 נ&quot;ב ל -300 נ&quot;ב (שבר היעד הוא 244 נקודות בסיס). טעינת נפח תגובה כל PCR (מתוכם ~ 23μl נותרים) של מועמדים אלה עם צבע 6μl טעינת 5x על 2 ethidium ברומיד% מוכתם agarose ג&#39;ל ולהפעיל למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הג&#39;ל על transilluminator-UV (Bioblock מדעי) ובחן ויזואלית. ראה דוגמה באיור 2. להקות והבלו הגודל הנכון של ג&#39;ל עם אזמל והניח לתוך צינורות בודדים 1.5 תגובה מ&quot;ל. לטהר שברי מן ג&#39;ל, למשל עם השחזור Zymoclean ג&#39;ל DNA Kit (Zymo מחקר). </li></ol> 5. סידור וזיהוי של PCR מוצרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע סנגר רצף של שברי היעד, למשל על ברצף ABI 3730 נימי עם ABI ביג דיי 3.1 כימיה (Applied Biosystems). הכן התגובות ברצף בכמויות 10μl המכיל 10-20 ng ג&#39;ל מטוהרים cDNA תבנית, דילול 1.75μl 5x חיץ, 0.5μl ביג premix דיי v3.1, 1 פריימר קדימה μl (M52C 20, 10 מ&quot;מ), ו ddH2O. תנאי רכיבה על אופניים הם: 1 denaturation דקות הראשונית, ואחריו 25 מחזורים של: 10 שניות על 96 מעלות צלזיוס, 5 ים ב 45 ° C ו 4 דק &#39;ב 60 ° C. לטהר ולהכין את התגובה סידור לפי פרוטוקולים פנימיים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי וכתוצאה מכך רצפי cDNA מול מסדי נתונים נוקלאוטיד כגון GenBank23, למשל על ידי כלים מבוססי אינטרנט כגון תפציץ במרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (צמח השדה, <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. נציג תוצאות: מולארד (אנס platyrhynchos) נדגמו על Ottenby Bird Observatory בדצמבר 2007. מתוך כל ברכייה מדגם על FTA כרטיס נלקח כמתואר בפרוטוקול זה. לאחר המשלוח, הקלפים FTA נשמרו במקפיא ב -20 ° C למשך שנתיים. המדגם אותו כרטיס FTA המעבדה לבודד נבדק קראוס ואח&#39;. 18 נכלל כביקורת חיובית, כמו גם תשעה דילולים סדרתי פי עשרה מזה. שני פקדים היו שליליות i) מיצוי מכרטיס FTA ריקה, כדי לבחון אם יש לשאת מעל מ אגרופן, ואת ii) RT-PCR תגובה שבה מים nuclease חינם שימש כתבנית, כדי לבדוק אם הזיהום התרחשו במהלך, או כהכנה התגובה PCR. 84 דגימות נותחו. תמונה ג&#39;ל של מוצרי ה-PCR מתוך 84 דגימות אלה ניתן למצוא באיור 1. ממדגמים טבעי מספר רב של להקות נוקבים ניתן לצפות בשל נוכחותם של זיהומים חיידקים שונים הצואה. עם זאת, שבר היעד של הצמד פריימר הוא 244 נ&quot;ב ארוך. נפח כולו PCR-תגובת משנה של דגימות שהפיקה שברי בטווח של כ הגודל הנכון (בין 200 נ&quot;ב ל -300 נ&quot;ב) הועמס על ג&#39;ל (איור 1). איור של איזה להקות קוצצו מן הג&#39;ל ניתן למצוא באיור משלים 1. בנוסף שליטה חיובית, שניים דגימות אלה (69,899 ו 69,912) היו חיוביות ידי פרוטוקול חדש. חיפוש תפציץ נגד באתר צמח השדה נוקלאוטיד חשפה את זהותם כמו AI מטריצה ​​גן (איור 3), בעוד כל הלהקות האחרות דמה רצפים חיידקי צמוד ביותר, או לא הניב רצף קריא בכלל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" /> באיור 1. ג&#39;ל תמונה של סינון ראשוני של מוצרי ה-PCR. 2 μl מוצר ה-PCR חיובי של שליטה, שלדילולים erial שליטה חיובית, שני פקדים שלילית 84 דגימות ביוב הועמסו. 48 דגימות מוצגים בלוח ג&#39;ל העליון, 48 דגימות בלוח התחתון. החיצים האדומים מציינים נתיבים ג&#39;ל המשמש 100 רגיל בגודל bp-DNA. לצורך המחשה, עיגולים אדומים להראות להקות טווח הגודל המצופה. חוגים כחול עולה amplicon נוקבים (למעלה משמאל) או דימר פריימר artefact להלן 100 נ&quot;ב בגודל (מימין למטה). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" /> איור 2. דוגמאות מבחר דוגמאות עם שברי בטווח הגודל הנכון. עם להקות בין 200 נ&quot;ב ל -300 נ&quot;ב (שבר יעד 244 נ&quot;ב) נבחרו. החץ הירוק מצביע על שליטה חיובית, שני החצים האדומים מצביעים על דגימות אשר אושרו להיות חיוביים AIV ידי השוואת רצפי cDNA שלהם באתר צמח השדה נוקלאוטיד. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" /> איור 3. לכידת מסך של חיפוש פיצוץ היציג באותו צמח השדה. אחד רצפי cDNA שהתקבלו שברי נכרת היה שאילתה מול מסד הנתונים של נוקלאוטיד באתר צמח השדה. המדגם מזוהה כהלכה כמו שבר גן מטריקס AI. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">כדי לצפות בגרסה בגודל מלא של תמונה זו, לחץ כאן.</a> <img alt="משלים איור 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" /> איור משלים S1. להקות של דגימות נבחר נכרת מן ג&#39;ל. תמונה זו נלקח הג&#39;ל מתואר באיור 1 אחרי להקות מועמד בין 200 נ&quot;ב ל -300 נ&quot;ב נחתכו החוצה.

<ol>
	<li>Pulido, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+evolution+of+avian+migration.">The genetics and evolution of avian migration.</a> BioScience. 57, 165-174 (2007).</li><li>Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza:+An+ecological+and+evolutionary+perspective+for+waterbird+scientists.">Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists.</a> Waterbirds. 29, 243-257 (2006).</li><li>Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+virulence+of+the+1918+"Spanish"+influenza+virus.">The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus.</a> Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).</li><li>Butler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+flu+goes+global.">Swine flu goes global.</a> Nature. 458, 1082-1083 (2009).</li><li>Normile, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza.+Wild+birds+only+partly+to+blame+in+spreading+H5N1.">Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1.</a> Science. 312, 1451-14 (2006).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+global+H5N1+outbreaks+match+bird+migration+patterns.">Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns.</a> Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+the+spread+of+the+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+virus+in+wild+birds+in+Europe.">Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe.</a> Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+dissemination+of+H5N1+viruses+isolated+during+an+influenza+outbreak+in+migratory+waterfowl+in+Western+China.">Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China.</a> J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).</li><li>Gaidet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+viruses+in+water+birds.">Avian influenza viruses in water birds.</a> Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+in+migratory+birds+and+evidence+of+limited+intercontinental+virus+exchange.">Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange.</a> PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).</li><li>Parmley, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+bird+influenza+survey,+Canada,+2005.">Wild bird influenza survey, Canada, 2005.</a> Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).</li><li>Wallensten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+influenza+A+virus+in+migratory+waterfowl+in+northern+Europe.">Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).</li><li>Munster, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+high-throughput+influenza+A+virus+surveillance+studies+of+wild+birds+by+use+of+molecular+diagnostic+tests.">Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).</li><li>Latorre-Margalef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+influenza+A+virus+infection+on+migrating+mallard+ducks.">Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).</li><li>Runstadler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RRT-PCR+analysis+and+virus+isolation+to+determine+the+prevalence+of+avian+influenza+virus+infections+in+ducks+at+Minto+Flats+State+Game+Refuge,+Alaska,+during+August+2005.">Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005.</a> Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).</li><li>Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+preservative+on+recoverable+RT-PCR+amplicon+length+from+influenza+A+virus+in+bird+feces.">Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces.</a> Avian Dis. 51, 965-968 (2007).</li><li>Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sample+type,+temperature+and+RNAlater+(TM)+on+the+stability+of+avian+influenza+virus+RNA.">The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA.</a> J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).</li><li>Kraus, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+surveillance:+On+the+usability+of+FTA+cards+to+solve+biosafety+and+transport+issues.">Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues.</a> Wildfowl. , 215-223 (2009).</li><li>Smith, L. M., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting,+archiving+and+processing+DNA+from+wildlife+samples+using+FTA+databasing+paper.">Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper.</a> BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).</li><li>Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription+of+an+RNA+genome+from+databasing+paper+(FTA).">Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA).</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).</li><li>Rogers, C., Burgoyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+typing:+Storing+and+processing+of+stabilized+reference+bacteria+for+polymerase+chain+reaction+without+preparing+DNA+-+An+example+of+an+automatable+procedure.">Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure.</a> Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).</li><li>Fouchier, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+influenza+a+viruses+from+different+species+by+PCR+amplification+of+conserved+sequences+in+the+matrix+gene.">Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene.</a> J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).</li><li>Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Res. 38, 46-51 (2009).</li><li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes.">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li><li>Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FTA+cards+as+a+laboratory+and+field+sampling+device+for+the+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus+and+serotyping+by+RT-PCR+and+real-time+RT-PCR.">Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).</li><li>Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FTA+filter+paper+for+the+molecular+detection+of+Newcastle+disease+virus.">Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus.</a> Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).</li></ol>

השמנה, טיפול דגימה של ציפורים נעשו בעקבות החקיקה הארצית אושרו על ידי מועצת שוודית החקלאות החיה מחקר ועדת האתיקה.

פרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה משלים מסך דגימות צואה או דומה לנוכחות של AIV. הוא תוכנן במיוחד כדי להפוך אוסף מדגם מהירה וקלה. זה מאפשר לאנשים מיומנים פחות, כמו ציידים או מנהלי טבע, לתרום מעקב AI. אין רשתות מגניב צריך להיות מיושם, למרות הקפאת דגימות מומלץ במידת האפשר. כמה ימים של בטמפרטורת החדר, למשל במהלך ההובלה למעבדה, לא היו בעיה של מולקולות RNA על כרטיסי FTA, כל עוד כרטיסים נותרו יבשות. אחרים ללא כוונת מקורר מערכות אחסון מוערכים כיום על ידי קהילת המחקר, כגון אלכוהול 15 או 16 guanidine, דורשים הסדרים משלוח מיוחד בשל אופיו מסוכנים שלהם. לעומת זאת, השיטה כרטיס FTA אינו מחייב משלוח של חומרים מסוכנים. עם זאת, אחר בינוני אחסון מעניין בהקשר זה הוא RNAlater ™ זה לא מסוכן, או 17. ניתוח לדוגמה יכול להתבצע במעבדה כל מולקולרי רגיל. אין ציוד מיוחד אחר מאשר כרגיל PCR תגובות וסדר נימי היה צורך. כל השלבים יכול להתבצע ללא רמה biosafety כי כבר אוסף המדגם סוכני פתוגניים פוטנציאל היו מומת על ידי פעילות נגד חיידקים נגיפים של כרטיס FTA. חוצה זיהום ובעקבות דגימות חיוביות כוזבות לא נצפו בניסויים שלנו עם דגימות צפור פראית. עם זאת, כאשר עובדים עם RNA ו-PCR זה תמיד רצוי להקדיש תשומת לב מיוחדת לנקות מקומות עבודה בחדרים נפרדים עבור שלבים לפני ואחרי-PCR. עבודה במנדף עשן מקטין את הסיכון של זיהום אירוסול במעבדה. Pipetting צריך להתבצע עם טיפים הסינון. ממחקר קודם על דגימות שנלקחו בעת ובעונה אחת מן ברווזים אותו אנו יודעים כי שישה מתוך 84 דגימות היו חיוביות ידי RealTime המסורתי RT-PCR שיטה 24 והערכים Ct מ RealTime RT-PCR ידועים. שתי דגימות חיוביות זוהה על ידי גזע השיטה שלנו ברווזים שהיו ערכים Ct &lt;30 (המעיד על ריכוז גבוה של רנ&quot;א נגיפי). ארבע הדוגמאות האחרות אשר היו חיוביות עם פרוטוקול המסורתי היו לערכים Ct&gt; 30 (מרוכז פחות) לא יכול להיות מזוהים על ידי פרוטוקול שלנו. דגימות נגיף רק עם titers גבוהה יחסית היו חיוביות assay שלנו, סביר להניח כי הרגישות של השיטה היה מקור הכישלון כדי לזהות את כל דגימות חיוביות. יתר על כן, גודל המדגם במחקר הנוכחי היה נמוך מאוד ואת השיטה ניתן לפתח לחלוטין להעריך אם ניסויים מבוקרים יותר קפדני מתבצעות. עם זאת, אם אלה היו דוגמאות שנאספו באזור מרוחק, ניתוח מסורתי לא היה אפשרי בכלל. בנוסף, אלה התוצאות הראשונות נובעות ניסויי פיילוט אשר צריך אופטימיזציה נוספת. תקופה של שנתיים אחסון בתוך מקפיא רגיל -20 ° C לאחר איסוף דגימת כנראה השפיע גם על האיכות של רנ&quot;א נגיפי. זו השפלה אפשרי RNA הוא נושא חשוב בהתמודדות עם אחסון בטמפרטורת חדר של וירוסים מומת. דוגמאות מאוחסנים נוזלים חלופה כאמור סובלים השפלה משמעותי אשר משפיע על ניתוח מותח יותר של הגנום הויראלי 16. אמנם לא נבדק במחקר שלנו, כרטיסי FTA הוכיחו להיות מתאים גם כדי לשמור על שלמות מולקולות RNA אחרות מערכות רנ&quot;א דומים מאוד נגיפי שפעת העופות 25, 26.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב או מכשיר </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> פלסטיק זהורית יבש ספוגית </td><td> קופאן, איטליה </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> כרטיס FTA </td><td> Whatman </td><td></td><td> כמה אפשרויות </td></tr><tr><td> האריס מיקרו אגרוף 2mm עם מחצלת </td><td> Whatman </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> RNase חינם 96well צלחת </td><td> גריינר Bio-One </td><td> 652290 </td><td> או דומה </td></tr><tr><td> קים דיוק מגבונים </td><td> Kimtech </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> RNA פתרון מהיר החילוץ </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX-96 ערכת בידוד נגיפי </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> One-Step RT-PCR גישה למערכת </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> או דומה </td></tr><tr><td> Agarose MP </td><td> רוש </td><td> 1388991001 </td><td> רב תכליתי agarose </td></tr><tr><td> טעינת 5x חיץ </td><td> BioRad </td><td></td><td> נמסר עם סולם DNA </td></tr><tr><td> EZ 100 נ&quot;ב לטעון סולם </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> או דומה </td></tr><tr><td> Ethidium ברומיד 1% </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> או דומה </td></tr><tr><td> תגובה צינורות 1.5ml </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> או דומה </td></tr><tr><td> Zymoclean ג&#39;ל DNA התאוששות ערכת </td><td> Zymo מחקר </td><td> D4001 </td><td> או דומה </td></tr><tr><td> ABI גדול לצבוע 3.1 כימיה </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td> או דומה </td></tr></tbody></table>

avian influenza surveillance with fta  cards: field methods, biosafety, and transportation issues solved

נגיפי שפעת העופות (AIVs) להדביק יונקים רבים, כולל בני אדם 1. AIVs אלה הם מגוונים המארחים הטבעי שלהם, מחסה כמעט את כל תת ויראלי אפשרי 2. מגיפות שפעת במקור של האדם נובעות AIVs 3. במקרים רבים אדם קטלנית במהלך התפרצויות H5N1 בשנים האחרונות דווחו. באחרונה זן חדש AIV הקשורות ששטפו את האוכלוסייה האנושית, גרימת 4 של מגיפת שפעת החזירים &quot;. למרות סחר אנושי פעילות התחבורה שנראה אחראי להתפשטות של זנים פתוגניים מאוד 5, הפיזור יכול גם לייחס בחלקו ציפורי בר 6, 7. עם זאת, המאגר בפועל של כל זני AIV הוא ציפורי בר. בתגובה זו מול הפסדים מסחרי חמורה בענף העופות, תוכניות מעקב גדול יושמו ברחבי העולם כדי לאסוף מידע על האקולוגיה של AIVs, ולהתקין מערכות התרעה לגילוי זנים פתוגניים מסוימים מאוד 8-12. שיטות מסורתיות דורשות virological וירוסים להיות שלמים מעובדים לפני ניתוח. זה מחייב רשתות קר מחמירים עם מקפיאים עמוק וכבד נהלים biosafety להיות במקום במהלך ההובלה. מעקב לטווח ארוך ולכן הוא מוגבל בדרך כלל תחנות בשדה כמה קרוב במעבדות מצוידות היטב. באזורים מרוחקים ולא ניתן שנדגמו אלא הליכים מסורבלים מבחינה לוגיסטית מיושמים. בעיות אלה הוכרו 13, 14 והשימוש אחסון חלופי ואסטרטגיות תחבורה נחקר (כהלים או guanidine) 15-17. לאחרונה, הציג קראוס ואח&#39;. 18 שיטה לאסוף, לאגור ולהעביר דגימות AIV, המבוסס על נייר מסנן מיוחד. FTA כרטיסים 19 לשמר RNA על בסיס אחסון יבש 20 ו לדקלם פתוגנים פעיל במגע 21. מחקר זה הראה כי כרטיסי FTA יכול לשמש כדי לזהות AIV רנ&quot;א הפוכה שעתוק PCR וכי cDNA וכתוצאה מכך יכול להיות רצף גנים וירוס ונחוש. במחקר של קראוס ואח&#39;. 18 מעבדה לבודד של AIV היה בשימוש, דגימות טופלו בנפרד. בשנת ההארכה שהוצגו כאן, דגימות צואה מן ציפורי בר ממלכודת ברווז על ציפור Ottenby במצפה (SE שוודיה) נבדקו ישירות כדי להמחיש את התועלת של שיטות בתנאי שדה. לתפוס ברווזים אוסף מדגם ידי דגימות ביוב מודגם. פרוטוקול הנוכחית כוללת למעלה דרוג של זרימת עבודה מתוך טיפול צינור אחד לעצב 96-היטב. למרות רגיש פחות מאשר שיטות מסורתיות, שיטת FTA כרטיסי מספק תוספת מצוינת תוכניות מעקב גדולים. היא מאפשרת איסוף וניתוח של דגימות מכל מקום בעולם, ללא צורך בשמירה על שרשרת מגניב או תקנות הבטיחות לגבי משלוח של חומרים כימיים מסוכנים, כגון אלכוהול או guanidine.

Watch this Scientific Journal Video about Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved at JoVE.com

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

שיטה לשמר, לזהות רצף הרנ&quot;א מפני וירוסים שפעת העופות היה תוקף המורחבת באמצעות דגימות צואה טבעיים ציפורים. טכניקה זו מסירה את הצורך של שמירה על שרשרת מגניב וטיפול וירוסים זיהומיות ניתן ליישם תוכנית ההתקנה של תפוקה גבוהה 96-היטב.

מעקבים שפעת העופות FTA עם כרטיסי: שיטות שדה, biosafety, וסוגיות התחבורה נפתר

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

אבחון מהיר של וירוס שפעת העופות בעופות בר: שימוש ניידים rRT-PCR ו מיובשים בהקפאה ריאגנטים בתחום

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

דוגמנות מחזור החיים של נגיף האבולה תחת 2 תנאים ברמת בטיחות ביולוגיים עם חלקיקים כמו וירוס המכילים Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

יצירת וקטורים ההרפס העופות רקומביננטי עם CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

מעקב משופר כלבת באמצעות מבחן אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...