Ringraziamo Dibbits Bert per assistenza tecnica. L&#39;allevamento degli animali e il Gruppo Genomica, Università di Wageningen, Paesi Bassi, generosamente ci ha ospitato nel loro laboratorio. Il personale del Uccello Ottenby Observatory, in Svezia, si ringrazia per la cattura e il campionamento dei germani reali, in particolare Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson e Stina Andersson. Ringraziamo Sanne Svensson, Jonatan Qvist e Per-Axel Gjöres per riprese a Ottenby, e Mano Camon per le riprese in laboratorio. Daniel Bengtson fornito fotografie anatra bello per la parte video di questa pubblicazione. Ulteriore materiale libero da la Biblioteca immagine CDC pubblica (PHIL; <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a> ) è stato utilizzato: il microscopio elettronico (n. 280; dal Dott. Erskine Palmer) e illustrazione (n. 11823; da Douglas Giordania) del virus dell&#39;influenza. Il sostegno finanziario è stato dato dal KNJV (Royal Paesi Bassi Hunters Association), il Ministero olandese dell&#39;Agricoltura, della Faunafonds e la Stichting de Trusts Eik (sia in Olanda), il Consiglio svedese della ricerca (Grant no. 2007-20774) e la CE -fondato Newflubird progetto. Prodotti chimici isolamento di RNA sono stati un dono generoso di Ambion, Inc, l&#39;azienda RNA. Questo è il contributo n. 245 dal Bird Ottenby Osservatorio.

1. Anatra trapping e tamponamento cloacali <ol><li> Trappola dabbling anatre del genere Anas (o di altri volatili) in una gabbia di attirarli con le anatre esca o cibo, e metterli in scatole di cartone individuale. Tempo di trasporto nella scatola dovrebbe essere ridotto al minimo, per esempio, con l&#39;installazione di una stazione di campo a breve distanza per la trappola. Circostanze logistiche possono variare in ogni studio. La consulenza e l&#39;approvazione del relativo animale comitato etico deve essere ricercata per ogni nuovo set-up. In alternativa, anche cacciatore di uccelli abbattuti si possono degustare. </li><li> Estrarre il anatra della scatola tenendo le ali stretto al suo corpo. Esempio di un dropping fresca, che sarà presente nella maggior parte dei casi, direttamente dalla parte inferiore della scatola. Raccoglierli con un tampone sterile e applicare il liquido ad una carta Whatman FTA. In caso contrario, eseguire tampone cloacale. </li><li> Accendere l&#39;anatra sulla sua schiena. Questo consente l&#39;accesso alla cloaca e facilita campionamento. La cloaca è una struttura sporgente situata sotto l&#39;addome, vicino alla base della coda. Una persona con esperienza poteva contenere l&#39;uccello e il campione, allo stesso tempo, oppure una seconda persona può aiutare. </li><li> Inserire con cautela il tampone sterile in plastica rayon (Copan, Italia) circa 1 cm e fare un dolce vortice della cloaca. Rotolare il tampone con i fluidi dalla cloaca sulla superficie di una carta Whatman FTA. Dopo il campionamento è stato effettuato l&#39;immediato rilascio degli animali è auspicabile. </li><li> Asciugare le carte FTA a temperatura ambiente per almeno 1 ora, quindi archiviare ogni campione singolarmente in sacchetti di carta (es. buste). Lo storage è possibile a temperatura ambiente, possibilmente con perline di silice nei climi umidi. L&#39;invio e la ricezione di biosicurezza istituzioni ufficiali &#39;può permettere di mandare le carte accordo di libero scambio per posta ordinaria, dal momento che i patogeni diventano inattivi a contatto con la superficie della carta FTA. </li></ol> 2. Isolamento di RNA virale <ol><li> Estrarre il materiale carta FTA tra cui feci / fluido cloaca. Punch tre dischi con un perforatore 2 millimetri Harris e luogo tutti coloro in un pozzo di una piastra di RNasi libero 96well. Tra ogni nuovo campione, pulire accuratamente il nemico con l&#39;alcol e una precisione Kim wipe (Kimtech). Usare sempre controlli positivi e negativi. Un controllo positivo può essere costituito da un ceppo di laboratorio appena applicato a una carta di accordo di libero scambio o di un campione naturale che è conosciuto per produrre un risultato positivo. Come controllo negativo, punch out dischi da una scheda vuota FTA. Inoltre, lasciare libero un altro pozzo per un controllo PCR dopo nel tuo esperimento (con l&#39;acqua come modello). </li><li> Aggiungere 70μl RNA soluzione di estrazione rapida (Ambion) e termosaldato la piastra (AbGene Thermo-Sealer). Incubare 5 minuti su un agitatore a temperatura ambiente con la velocità stabilito che non provoca spill-over (questo dipende dal modello di piastra utilizzata shaker; test in anticipo). </li><li> Carry isolamento virale RNA secondo protocolli del produttore con il MagMAX-96 Kit di isolamento virale RNA (Ambion). In breve: Aggiungere 130μl preparato lisi / soluzione vincolante (dal kit) in ogni pozzetto. Trasferire 50μl estratto materiale carta FTA in ciascun pozzetto. Agitare piastra per 1 minuto. </li><li> Aggiungere 20μl miscela preparata tallone (dal kit) per ogni campione e mescolare pipettando su e giù. Agitare sulla velocità determinato per 5 minuti. Molecole di RNA si legano al sfere magnetiche. </li><li> Spostare la piastra ad una magnetica a 96 pozzetti stand per catturare le sfere. A seconda del modello di supporto magnetico utilizzato, questo può richiedere più di 5 minuti. Quando la soluzione si è rivelata del tutto chiare, rimuovere e scartare il surnatante. Quindi rimuovere la piastra dal supporto magnetico. </li><li> Lavare le perle due volte con la soluzione di lavaggio 1 e due volte con soluzione di lavaggio 2 (dal kit). Per ognuna delle 4 fasi di lavaggio aggiungere 150μl soluzione preparata di lavaggio per ogni campione, agitare per 1 minuto a velocità determinata, spostare il piatto per il supporto magnetico, la cattura perline per circa 5 minuti (o fino a quando la soluzione è del tutto chiaro), rimuovere e scartare il surnatante. Quindi rimuovere la placca dalla base magnetica, aggiungere la soluzione successiva lavaggio, ed eseguire le fasi di lavaggio come in precedenza. Dopo la fase di lavaggio scorso, rimuovere soluzione di lavaggio per quanto possibile, e aria secca le perline a temperatura ambiente nello shaker piastra per 2 minuti. </li><li> Aggiungere 50μl di tampone di eluizione (dal kit) per liberare l&#39;RNA dalle perline e agitare per 4 minuti in agitatore. Cattura perle come descritto in precedenza. Il supernatante ora contiene l&#39;RNA isolato che è pronta per le applicazioni a valle. </li></ol> 3. RT-PCR di Matrix AIV Gene Effettuare PCR di trascrizione inversa (RT-PCR) con l&#39;accesso di uno stadio di RT-PCR system (Promega) in 25 microlitri reazioni (regolato da Kraus et al 18 e Fouchier et al 22..): <table border="1"><tbody><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 tampone </td&gt; <td> 5μl </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Primer M52C 22 (10 mM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> Primer M253R 22 (10 mM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 mM) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV della trascrittasi inversa (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Polimerasi TfL (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> RNA campione </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> Condizioni di PCR in un T1 Biometra termociclatore sono: la trascrizione inversa iniziale di 45 minuti a 45 ° C, seguito da 2 minuti denaturazione iniziale a 94 ° C e 40 cicli di: 94 ° C per 1 minuto, 56 ° C per 1 minuto, e 68 ° C per 2 minuti. Un allungamento altri 7 minuti a 68 ° C si conclude l&#39;amplificazione. 4. Screening per AI-I campioni positivi e Purificazione di frammenti mirate da Gel <ol><li> 2μl carico del prodotto della PCR mescolato con 2μl colorante carico 5x (BioRad) e l&#39;acqua 6μl su un 1% gel (Roche) colorato con bromuro di etidio 1% (2.5μl per 100 ml di gel) per un pre-screening. </li><li> Esegui il gel per 1 ora a 120V, con un formato standard di DNA (BioRad carico EZ 100 bp ladder), visualizzare con un sistema di documentazione del gel. Vedere un esempio in Figura 1. </li><li> Selezionare i campioni con frammenti amplificati nella gamma di dimensioni previste (tra 200 bp e 300 bp (frammento obiettivo è di 244 bp). Carico l&#39;intero volume di reazione di PCR (di cui ~ 23μl sono a sinistra) di questi candidati con 6μl colorante carico 5x su un 2 etidio bromuro% gel colorato e correre per 2 ore. </li><li> Posizionare il gel su un transilluminatore UV (Bioblock scientifico) e ispezionato visivamente. Vedere un esempio in Figura 2. Bande di accisa di dimensioni corrette da gel con un bisturi e posto in provette 1,5 ml individuali di reazione. Purificare frammenti di gel, per esempio con il Zymoclean Recovery Kit DNA Gel (Zymo Ricerca). </li></ol> 5. Sequenziamento ed identificazione dei prodotti PCR <ol><li> Effettuare Sanger sequenziamento dei frammenti di destinazione, ad esempio su un sequenziatore ABI 3730 capillare con ABI Big Dye 3,1 chimica (Applied Biosystems). Preparare reazioni di sequenziamento dei volumi 10μl contenente 10-20 ng gel purificato modello cDNA, buffer 1.75μl diluizione 5x, 0.5μl Big Dye premix V3.1, 1 fondo microlitri avanti (M52C 20, 10 mm) e ddH2O. Condizioni di ciclismo sono: 1 min denaturazione iniziale, seguita da 25 cicli di: 10 s a 96 ° C, 5 s a 45 ° C e 4 minuti a 60 ° C. Purificare e preparare la reazione di sequenziamento secondo i protocolli interni. </li><li> Identificare sequenze di cDNA risultante nei database nucleotidici come GenBank23, ad esempio strumenti web based come BLAST presso il Centro Nazionale for Biotechnology Information (NCBI, <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Germano reale (Anas platyrhynchos) sono state campionate in Ottenby Bird Observatory nel dicembre 2007. Da ogni germano reale su un campione FTA scheda è stato preso come descritto in questo protocollo. Dopo la spedizione, le carte FTA sono stati tenuti in un congelatore a -20 ° C per due anni. Lo stesso campione di carta FTA del laboratorio di isolare testato in Kraus et al. 18 è stato incluso come controllo positivo, così come nove dieci volte diluizioni seriali di esso. Due sono stati i controlli negativi) l&#39;estrazione da una scheda vuota accordo di libero scambio, per verificare se ci fosse riporto dal perforatore, e ii) RT-PCR, reazione in cui è stato utilizzato nucleasi acqua libera, come modello, per verificare se la contaminazione si è verificato durante o in preparazione della reazione PCR. 84 campioni sono stati analizzati. Una foto gel dei prodotti di PCR da questi 84 campioni possono essere trovati nella Figura 1. Da campioni naturali una moltitudine di bande non specifiche può essere osservato a causa della presenza di contaminazioni microbiche diverse nelle feci. Tuttavia, il frammento di destinazione della coppia di primer è di 244 bp lungo. L&#39;intera reazione PCR volume di un sottoinsieme dei campioni che hanno prodotto frammenti in circa la gamma di dimensioni corrette (tra 200 bp e 300 bp) è stato caricato su gel (Figura 1). Un esempio di quale delle bande sono state tagliate dal gel si possono trovare nella figura di complemento 1. In aggiunta al controllo positivo, due di questi campioni (69.899 e 69.912) sono risultati positivi dal nuovo protocollo. Una ricerca BLAST contro il database NCBI nucleotide rivelato la loro identità di AI matrice gene (Figura 3), mentre tutte le altre band assomigliava sequenze batteriche più da vicino, o non producono una sequenza leggibile a tutti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" /> Figura 1. Immagine gel di uno screening preliminare dei prodotti di PCR. Microlitri 2 prodotto PCR di controllo positivo, sdiluizioni erial del controllo positivo, due controlli negativi e 84 campioni cloacali sono stati caricati. 48 campioni sono mostrati nel pannello in alto gel, e 48 campioni nel pannello inferiore. Frecce rosse indicano corsie gel utilizzato per 100 bp DNA di dimensioni standard. Per esempio, cerchi rossi mostrano bande nel range dimensioni previste. Cerchi blu indicano un amplicone aspecifica (in alto a sinistra) o di un manufatto dimero iniettore di sotto di 100 bp nel formato (in basso a destra). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" /> Figura 2. Selezione dei campioni con frammenti nell&#39;intervallo di grandezza corretto. Campioni con bande tra 200 bp e 300 bp (target frammento di 244 bp) sono stati scelti. La freccia verde indica il controllo positivo, le due frecce rosse indicano i campioni che sono stati confermati da AIV positiva mettendo a confronto le loro sequenze cDNA al database NCBI nucleotide. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" /> Figura 3. Cattura dello schermo di una ricerca BLAST rappresentante NCBI. Una delle sequenze cDNA ottenuto dai frammenti asportati è stato interrogato sul database nucleotide sul sito NCBI. Il campione viene correttamente identificate come frammento AI gene Matrix. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">Per visualizzare la versione completa di dimensioni di questa immagine, clicca qui.</a> <img alt="Supplementare Figura 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" /> Supplementare Figura S1. Bande di campioni selezionati escisse dal gel. Questa foto è stata scattata dal gel rappresentato in figura 1, dopo le bande candidato tra 200 bp e 300 bp sono stati tagliati fuori.

<ol>
	<li>Pulido, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+evolution+of+avian+migration.">The genetics and evolution of avian migration.</a> BioScience. 57, 165-174 (2007).</li><li>Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza:+An+ecological+and+evolutionary+perspective+for+waterbird+scientists.">Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists.</a> Waterbirds. 29, 243-257 (2006).</li><li>Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+virulence+of+the+1918+"Spanish"+influenza+virus.">The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus.</a> Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).</li><li>Butler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+flu+goes+global.">Swine flu goes global.</a> Nature. 458, 1082-1083 (2009).</li><li>Normile, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza.+Wild+birds+only+partly+to+blame+in+spreading+H5N1.">Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1.</a> Science. 312, 1451-14 (2006).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+global+H5N1+outbreaks+match+bird+migration+patterns.">Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns.</a> Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+the+spread+of+the+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+virus+in+wild+birds+in+Europe.">Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe.</a> Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+dissemination+of+H5N1+viruses+isolated+during+an+influenza+outbreak+in+migratory+waterfowl+in+Western+China.">Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China.</a> J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).</li><li>Gaidet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+viruses+in+water+birds.">Avian influenza viruses in water birds.</a> Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+in+migratory+birds+and+evidence+of+limited+intercontinental+virus+exchange.">Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange.</a> PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).</li><li>Parmley, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+bird+influenza+survey,+Canada,+2005.">Wild bird influenza survey, Canada, 2005.</a> Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).</li><li>Wallensten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+influenza+A+virus+in+migratory+waterfowl+in+northern+Europe.">Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).</li><li>Munster, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+high-throughput+influenza+A+virus+surveillance+studies+of+wild+birds+by+use+of+molecular+diagnostic+tests.">Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).</li><li>Latorre-Margalef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+influenza+A+virus+infection+on+migrating+mallard+ducks.">Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).</li><li>Runstadler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RRT-PCR+analysis+and+virus+isolation+to+determine+the+prevalence+of+avian+influenza+virus+infections+in+ducks+at+Minto+Flats+State+Game+Refuge,+Alaska,+during+August+2005.">Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005.</a> Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).</li><li>Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+preservative+on+recoverable+RT-PCR+amplicon+length+from+influenza+A+virus+in+bird+feces.">Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces.</a> Avian Dis. 51, 965-968 (2007).</li><li>Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sample+type,+temperature+and+RNAlater+(TM)+on+the+stability+of+avian+influenza+virus+RNA.">The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA.</a> J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).</li><li>Kraus, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+surveillance:+On+the+usability+of+FTA+cards+to+solve+biosafety+and+transport+issues.">Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues.</a> Wildfowl. , 215-223 (2009).</li><li>Smith, L. M., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting,+archiving+and+processing+DNA+from+wildlife+samples+using+FTA+databasing+paper.">Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper.</a> BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).</li><li>Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription+of+an+RNA+genome+from+databasing+paper+(FTA).">Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA).</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).</li><li>Rogers, C., Burgoyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+typing:+Storing+and+processing+of+stabilized+reference+bacteria+for+polymerase+chain+reaction+without+preparing+DNA+-+An+example+of+an+automatable+procedure.">Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure.</a> Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).</li><li>Fouchier, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+influenza+a+viruses+from+different+species+by+PCR+amplification+of+conserved+sequences+in+the+matrix+gene.">Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene.</a> J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).</li><li>Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Res. 38, 46-51 (2009).</li><li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes.">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li><li>Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FTA+cards+as+a+laboratory+and+field+sampling+device+for+the+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus+and+serotyping+by+RT-PCR+and+real-time+RT-PCR.">Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).</li><li>Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FTA+filter+paper+for+the+molecular+detection+of+Newcastle+disease+virus.">Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus.</a> Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).</li></ol>

Cattura, manipolazione e degustazione di uccelli sono stati fatti a seguito della legislazione nazionale e sono stati approvati dal Consiglio svedese per l&#39;Agricoltura e l&#39;animale comitato di ricerca etica.

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo supplementare per lo screening dei campioni fecali o simili per la presenza di AIV. E &#39;stato appositamente studiato per rendere la raccolta del campione rapido e facile. Questo rende possibile per le persone meno allenati, come cacciatori o gestori della fauna selvatica, per contribuire alla sorveglianza AI. Nessuna catena fresco devono essere applicate, anche se il congelamento dei campioni è consigliabile, ove possibile. Pochi giorni di temperatura ambiente, per esempio durante il trasporto al laboratorio, non erano un problema per le molecole di RNA su schede FTA, fino a quando le carte sono rimasti a secco. Altri non raffreddato sistemi di storage che sono attualmente valutati dalla comunità di ricerca, come l&#39;alcool 15 o guanidina 16, richiedono particolari modalità di spedizione a causa della loro natura pericolosa. Al contrario, il metodo della carta FTA non richiede spedizione di materiali pericolosi. Tuttavia, un altro supporto di memorizzazione interessante a questo riguardo è RNAlater ™ che non è pericoloso, sia 17. Analisi dei campioni può essere effettuata in qualsiasi standard di laboratorio molecolare. Nessuna attrezzatura speciale diverso dal solito per reazioni di PCR e il sequenziamento capillare era necessario. Tutte le fasi potrebbe essere effettuata senza un livello di biosicurezza perché già al momento della raccolta dei campioni di agenti patogeni potenziali sono stati inattivati ​​dalla attività antibatterica e antivirale della carta FTA. Contaminazione incrociata e successive campioni falsi positivi non sono stati osservati nelle nostre prove con campioni di uccelli selvatici. Tuttavia, quando si lavora con l&#39;RNA e PCR è sempre consigliabile prestare particolare attenzione per la pulizia dei luoghi di lavoro e stanze separate per le fasi pre-e post-PCR. Lavorare in una cappa aspirante diminuisce il rischio di contaminazione da aerosol in laboratorio. Pipettaggio deve essere effettuata con puntali con filtro. Da uno studio precedente su campioni prelevati simultaneamente dal anatre stessa sappiamo che sei dei 84 campioni sono risultati positivi con il tradizionale RealTime RT-PCR 24 e i valori di Ct da RealTime RT-PCR sono noti. I due campioni positivi rilevati dal nostro staminali metodo di anatre che erano i valori Ct &lt;30 (che indica una alta concentrazione di RNA virale). Gli altri quattro campioni sono risultati positivi con il protocollo tradizionale aveva valori Ct&gt; 30 (meno concentrato) e non potrebbe essere rilevato dal nostro protocollo. Campioni solo con titoli di virus relativamente alta sono risultati positivi nel nostro test ed è probabile che la sensibilità del metodo è stata la fonte di mancato riconoscimento di tutti i campioni positivi. Inoltre, la dimensione del campione in questo studio era molto bassa e il metodo può essere completamente sviluppato e valutato se gli esperimenti più controllata e rigorosa vengono effettuate. Tuttavia, se questi campioni sarebbero stati raccolti da una zona remota, l&#39;analisi tradizionali non sarebbe stato possibile a tutti. Inoltre, questi primi risultati derivano da esperimenti pilota che hanno bisogno di un&#39;ulteriore ottimizzazione. Un periodo di due anni in un deposito regolare congelatore -20 ° C dopo la raccolta del campione, probabilmente influenzato anche la qualità del RNA virale. Questa degradazione dell&#39;RNA possibile è una questione importante quando si tratta di stoccaggio a temperatura ambiente di virus inattivati. Campioni conservati nei liquidi alternativa come detto sopra soffrono di un notevole degrado che incide di più si estende l&#39;analisi del genoma virale 16. Anche se non testati nel nostro studio, le carte FTA hanno dimostrato di essere adatto a preservare intatto molecole di RNA in altri sistemi di RNA che sono molto simili ai virus dell&#39;influenza aviaria, 25, 26.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente o strumento </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Plastica rayon tampone a secco </td><td> Copan, Italia </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> FTA card </td><td> Whatman </td><td></td><td> diverse opzioni </td></tr><tr><td> Harris micro perforazione 2mm con tappetino </td><td> Whatman </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi libero 96well piatto </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 652290 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Kim precisione salviette </td><td> KIMTECH </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> RNA estrazione rapida soluzione </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX-96 kit di isolamento virale </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> One-Step accesso RT-PCR sistema </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Agarosio MP </td><td> Roche </td><td> 1388991001 </td><td> multiuso agarosio </td></tr><tr><td> Di caricamento del buffer 5x </td><td> BioRad </td><td></td><td> consegnato con scaletta del DNA </td></tr><tr><td> EZ carico di 100 bp ladder </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Etidio bromuro 1% </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Provette 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> Zymoclean Gel DNA recupero kit </td><td> Zymo ricerca </td><td> D4001 </td><td> o assimilabili </td></tr><tr><td> ABI grande colorante 3,1 chimica </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td> o assimilabili </td></tr></tbody></table>

avian influenza surveillance with fta  cards: field methods, biosafety, and transportation issues solved

I virus dell&#39;influenza aviaria (AIVs) infettare molti mammiferi, compresi gli esseri umani 1. Queste AIVs sono diversi nei loro ospiti naturali, l&#39;ospitare quasi tutti i possibili sottotipi virali 2. Pandemie influenzali umani di origine derivano da AIVs 3. Molti casi mortali umani durante la focolai di H5N1 negli ultimi anni sono stati segnalati. Ultimamente, un nuovo ceppo AIV relativi attraversò la popolazione umana, causando 4 il &#39;epidemia di influenza suina&#39;. Anche se di trading e dell&#39;attività umana trasporto sembra essere responsabile della diffusione di ceppi altamente patogeni 5, la dispersione può anche essere in parte attribuito a uccelli selvatici 6, 7. Tuttavia, la riserva reale di tutti i ceppi AIV è uccelli selvatici. In reazione a questo e di fronte alle gravi perdite commerciali nel settore del pollame, i programmi di sorveglianza di grandi dimensioni sono stati implementati a livello globale per raccogliere informazioni sull&#39;ecologia di AIVs, e di installare sistemi di allarme rapido per rilevare alcuni ceppi altamente patogeni 8-12. I metodi tradizionali di virus virologica richiedono di essere integro e coltivato prima dell&#39;analisi. Ciò richiede rigorosa catena del freddo con congelatori e pesanti le procedure di biosicurezza essere a posto durante il trasporto. A lungo termine di sorveglianza è quindi di solito limitata ad una delle stazioni di campo di alcuni stretti ai laboratori ben attrezzati. Aree remote non possono essere oggetto di campionamento a meno che le procedure logisticamente complicato l&#39;attuazione. Questi problemi sono stati riconosciuti 13, 14 e l&#39;utilizzo dello stoccaggio e strategie alternative di trasporto indagato (alcoli o guanidina) 15-17. Recentemente, Kraus et al. 18 ha introdotto un metodo per raccogliere, immagazzinare e trasportare campioni di AIV, basato su una carta speciale filtro. FTA 19 carte preservare l&#39;RNA su una base di stoccaggio a secco 20 e rendere inattivi gli agenti patogeni a contatto 21. Questo studio ha dimostrato che le carte FTA può essere utilizzato per rilevare AIV RNA in PCR di trascrizione inversa e che il cDNA risultante potrebbe essere sequenziato i geni del virus e determinato. Nello studio di Kraus et al. 18 un laboratorio isolato di AIV è stato utilizzato, ei campioni sono stati trattati singolarmente. Nella estensione qui presentata, campioni di feci di volatili selvatici dalla trappola d&#39;anatra al Uccello Ottenby Observatory (SE Svezia) sono stati testati direttamente per illustrare l&#39;utilità dei metodi in condizioni reali. Cattura di anatre e raccolta dei campioni da tamponi cloacali è dimostrata. Il protocollo attuale prevede up-scaling del flusso di lavoro dalla gestione singolo tubo di un design a 96 pozzetti. Anche se meno sensibili rispetto ai metodi tradizionali, il metodo di FTA carte offre un ottimo complemento ai sistemi di sorveglianza di grandi dimensioni. Esso consente la raccolta e l&#39;analisi di campioni provenienti da ogni parte del mondo, senza la necessità di mantenimento di una catena fredda o norme di sicurezza rispetto alla spedizione di reagenti pericolosi, come l&#39;alcool o guanidina.

Watch this Scientific Journal Video about Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved at JoVE.com

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Un metodo per preservare, rilevare e sequenza di RNA da virus dell&#39;influenza aviaria è stato convalidato ed esteso usando naturale campioni di feci di uccelli. Questa tecnica elimina la necessità di mantenere una catena del freddo e la manipolazione di virus infettivo e può essere applicato in un 96-e high-throughput di setup.

Sorveglianza dell&#39;influenza aviaria con FTA Carte: metodi per i campi, Biosicurezza, e problemi di trasporto Risolto

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

La diagnosi rapida del virus dell&#39;influenza aviaria nei volatili selvatici: l&#39;uso di un Portable rRT-PCR e liofilizzato reagenti nel campo

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Modellazione il ciclo di vita Ebola Virus Sotto livello di biosicurezza 2 condizioni con particelle virus-simili contenenti Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitazione della proteina mouse Mx1 con il virus nucleoproteina Influenza A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizzando le risposte dell'anticorpo al virus A(H3N2) in sieri umani di Microneutralization l'Influenza di misurazione analisi utilizzando cellule MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Generazione di vettori ricombinanti Herpesvirus aviaria con CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

Sorveglianza della rabbia migliorata utilizzando un test immunoistochimico rapido diretto

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...