Name: high-throughput yeast plasmid overexpression screen
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00
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この作品は、ジョンズホプキンス大学でALS研究のためのパッカードセンター（ADG）、NIHのディレクターの新イノベーター賞1DP2OD004417 - 01（ADG）、NIH R01 NS065317（ADG）、リタアレン財団奨学生賞からの助成金によって支えられて。 ADGは、ピュー慈善財団がサポートしている医歯薬学総合研究でピュー学者です。

1。酵母の形質転換のための準備このプロトコルは、10、96ウェルプレート用に設計されていますが、それに応じて上または下に拡張することができます。我々は、このプロトコルは、変換のラウンドあたり20以上の96ウェルプレート用にうまく動作しないことがわかりました。全体の変換手順は（ステップI.3から）約8時間かかります。 <ol><li> BiorobotのRapidPlate液体ハンド?...

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	<li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nobel+Prize+and+beyond:+an+interview+with+Sir+Paul+Nurse.+Interview+by+Susan+R.+Owens.">The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens.</a> EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).</li><li>Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nobel+Lecture.+Yeast+and+cancer.">Nobel Lecture. Yeast and cancer.</a> Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).</li><li>Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+in+the+yeast+secretory+pathway+are+required+for+transport+of+carboxypeptidase+Y+to+the+vacuole.">Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole.</a> Cell. 30, 439-448 (1982).</li><li>Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+of+events+in+the+yeast+secretory+pathway.">Order of events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 25, 461-469 (1981).</li><li>Novick, P., Field, C., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+23+complementation+groups+required+for+post-translational+events+in+the+yeast+secretory+pathway.">Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 21, 205-215 (1980).</li><li>Sopko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression.">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21, 319-330 (2006).</li><li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+Gateway((R))+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24, 913-919 (2007).</li><li>Gelperin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).</li><li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae.">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17, 536-543 (2007).</li><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile.">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network.">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li><li>Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314, 130-133 (2006).</li><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).</li><li>Elden, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li><li>Johnson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+intrinsically+aggregation-prone,+and+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutations+accelerate+aggregation+and+increase+toxicity.">TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity.</a> J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).</li><li>Cooper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li><li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+and+Bread+to+Brains+and+Beyond:+Can+Yeast+Cells+Teach+Us+about+Neurodegenerative+Disease?.">Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li><li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity.">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li></ol>

ここでは、酵母における高スループットプラスミド過剰発現の画面を実行するためのプロトコルを提示する。このアプローチは、多くの異なる細胞の表現型の遺伝的修飾のための迅速かつ公平な審査が可能になります。このアプローチを使用して、研究者は数週間のうちに酵母ゲノムのかなりの部分を選別できます。この公平なアプローチは、以前の調査結果に基づいて予測されていない可?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> BioRobot RapidPlate </td><td>キアゲン</td><td> 9000490 </td></tr><tr><td> 96ボルトレプリケータ（フロッガー） </td><td> V＆Pサイエンティフィック</td><td> VP404 </td></tr><tr><td> FLEXGene ORF図書館</td><td>プロテオミクスの研究所、ハーバードメディカルスクール</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5810R </td></tr><tr><td> 500mLにバッフルフラスコ</td><td> Bellco </td><td> 2543〜00500 </td></tr><tr><td> 2.8Lトリプルバッフルフェルンバッハのフラスコ</td><td> Bellco </td><td> 2551〜02800 </td></tr><tr><td> 100μLRapidplateピペットチップ</td><td> Axygen </td><td> ZT - 100 - RS </td></tr><tr><td> 200μLRapidplateピペットチップ</td><td> Axygen </td><td> ZT - 200 - RS </td></tr></tbody></table>

high-throughput yeast plasmid overexpression screen

出芽酵母、 サッカロマイセスセレビシエは 、ヒトの疾患への直接的な関連性を有するものを含む多くの重要な細胞プロセス、の基本的なメカニズムを定義するための強力なモデルシステムです。で、短い世代時間と十分に特徴付けゲノムから、酵母のモデルシステムの主要experimental利点は、特定のプロセスに関与する遺伝子と経路を同定する遺伝子スクリーニングを実行する機能です。 30年間にわたってこのような遺伝子スクリーニングは、細胞周期、分泌経路、および真核細胞生物学1-5の多くの高度に保存された側面を解明するために使用されている。ここ数年では、酵母菌株とプラスミドのいくつかのゲノムワイドライブラリは6-10生成されている。これらのコレクションは、現在の利得と機能喪失型のアプローチ11-16を使用して遺伝子機能の系統的な尋問を可能にする。ここでは、5500酵母プラスミドのアレイライブラリを使用して、プラスミド過剰発現の画面を実行するために液体ハンドリングロボットによるハイスループット酵母の形質転換プロトコルを使用するための詳細なプロトコルを提供しています。我々は、凝集が発生しやすい人間の神経変性疾患のタンパク質の蓄積に関連付けられている毒性の遺伝的修飾を識別するために、これらの画面を使用している。ここで紹介する手法は、関心のある他の細胞の表現型の研究に迅速に適用可能であり。

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High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

ここではでプラスミド過剰発現の画面を説明<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;、アレイプラスミドライブラリーと液体ハンドリングロボットによるハイスループット酵母の形質転換プロトコルを使用して。

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

メタゲノムライブラリからセルラーゼ活性をBiominingためのハイスループットスクリーニング

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

ハイスループットSHAPEを使用したRNA二次構造予測

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚を用いた高スループットへのアプローチマニュアル小分子スクリーン

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

ハイスループットのアプリケーションのための大人のゼブラフィッシュハーツの回復

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

高スループット<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;エネルギー消費アッセイ

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...