Name: high-throughput yeast plasmid overexpression screen
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Packard Центр ALS исследований в Университете Джона Хопкинса (ADG), Нью-премии Новатор NIH директора 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), Рита Аллен Фонд ученый Award. ADG является выпускником школы Пью в медико-биологических наук, при поддержке Благотворительные фонды Пью.

1. Подготовка к преобразованию дрожжей Этот протокол разработан в течение десяти 96-луночных планшетах, но можно масштабировать вверх или вниз соответственно. Мы обнаружили, что этот протокол не работает уже более двадцати 96-луночных за раунд трансформации. Вся процедура ...

<ol>
	<li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nobel+Prize+and+beyond:+an+interview+with+Sir+Paul+Nurse.+Interview+by+Susan+R.+Owens.">The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens.</a> EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).</li><li>Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nobel+Lecture.+Yeast+and+cancer.">Nobel Lecture. Yeast and cancer.</a> Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).</li><li>Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stages+in+the+yeast+secretory+pathway+are+required+for+transport+of+carboxypeptidase+Y+to+the+vacuole.">Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole.</a> Cell. 30, 439-448 (1982).</li><li>Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+of+events+in+the+yeast+secretory+pathway.">Order of events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 25, 461-469 (1981).</li><li>Novick, P., Field, C., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+23+complementation+groups+required+for+post-translational+events+in+the+yeast+secretory+pathway.">Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 21, 205-215 (1980).</li><li>Sopko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression.">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21, 319-330 (2006).</li><li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+Gateway((R))+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24, 913-919 (2007).</li><li>Gelperin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).</li><li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae.">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17, 536-543 (2007).</li><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast.">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).</li><li>Mnaimneh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles.">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li><li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile.">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network.">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li><li>Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314, 130-133 (2006).</li><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).</li><li>Elden, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li><li>Johnson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+intrinsically+aggregation-prone,+and+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutations+accelerate+aggregation+and+increase+toxicity.">TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity.</a> J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).</li><li>Cooper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li><li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+and+Bread+to+Brains+and+Beyond:+Can+Yeast+Cells+Teach+Us+about+Neurodegenerative+Disease?.">Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li><li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity.">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li></ol>

Здесь мы приводим протокол для выполнения высокой пропускной способности плазмиды экране гиперэкспрессия в дрожжах. Такой подход позволяет оперативно и объективную скрининг на генетические модификаторы многих различных клеточных фенотипов. Используя этот подход, исследователь мож...

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> Биоробот RapidPlate </td><td> Qiagen </td><td> 9000490 </td></tr><tr><td> 96 болт репликатор (Frogger) </td><td> V &amp; P Научные </td><td> VP404 </td></tr><tr><td> FLEXGene ORF библиотека </td><td> Институт протеомики, Гарвардской медицинской школы </td><td></td></tr><tr><td> Настольная центрифуга </td><td> Эппендорф </td><td> 5810R </td></tr><tr><td> 500 мл колбу тупик </td><td> Bellco </td><td> 2543-00500 </td></tr><tr><td> 2.8L тройной тупик FERNBACH колбу </td><td> Bellco </td><td> 2551-02800 </td></tr><tr><td> 100 мкл Rapidplate наконечники </td><td> Axygen </td><td> ZT-100-RS </td></tr><tr><td> 200 мкл Rapidplate наконечники </td><td> Axygen </td><td> ZT-200-RS </td></tr></tbody></table>

high-throughput yeast plasmid overexpression screen

Почкующихся дрожжей, Saccharomyces CEREVISIAE, представляет собой мощную систему модель для определения фундаментальных механизмов многих важных клеточных процессов, в том числе имеет непосредственное отношение к болезни человека. Из-за короткого времени генерации и хорошо изученных геномов, основным преимуществом экспериментальной модели системы дрожжей способность выполнять генетических экранов, чтобы идентифицировать гены и пути, которые участвуют в данном процессе. За последние тридцать лет такие генетические экраны были использованы для выяснения клеточного цикла, секреторный путь, и многие другие высоко консервативные аспекты эукариотической клеточной биологии 1-5. В последние несколько лет, несколько библиотек genomewide штаммов дрожжей и плазмиды были получены 6-10. Эти коллекции позволяют сейчас для систематического допроса функции гена использованием усиления и потерей функции подходы 11-16. Здесь мы предлагаем подробный протокол для использования высокопроизводительного протокола трансформация дрожжи с жидкого робота выполнять обработку плазмиды экране гиперэкспрессия, используя выстроил библиотеку в 5500 плазмиды дрожжей. Мы используем эти экраны для выявления генетических модификаторов токсичность, связанная с накоплением агрегации подверженных человека нейродегенеративные заболевания белки. Методы, представленные здесь, могут быть легко приспособлены к изучению других клеточных фенотипов интерес.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen at JoVE.com

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Здесь мы опишем плазмиды экране гиперэкспрессия в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em&gt;, С помощью выстроились плазмиды библиотеки и высокой пропускной способности дрожжей преобразования протоколов с жидкого робота обработки.

Высокая пропускная способность дрожжей плазмиды экрана Сверхэкспрессия

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Экран с высоким Пропускная Biomining Целлюлаза активность метагеномных из библиотеки

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Высокая пропускная способность осахаривания Пробирной для лигноцеллюлозной материалы

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Высокая пропускная способность очистки Affinity с метками рекомбинантных белков

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

РНК предсказание вторичной Структура Использование высоких-пропускная способность SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Высокая пропускная Микроинъекции из морского ежа зиготы

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Высокая пропускная Титрование люциферазы экспрессирующих рекомбинантные вирусы

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Руководство маленькая молекула экрана Подойдя высокой пропускной Использование эмбрионов данио

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Восстановление взрослых данио сердца для высокой пропускной приложений

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Высокая пропускная способность<em&gt; Данио Rerio</em&gt; Анализ Расход энергии

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...