Name: laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration
Uploaded: 2011-08-29T13:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration at JoVE.com

نشكر أعضاء المختبر لاجراء مناقشات مفيدة Wingert البيولوجيا آكي الزرد والتقنيات ، وديب جيم لتبادل وصفته methylcellulose. الكتاب كما أود أن أعرب عن امتناننا للموظفين في مركز نوتردام للبحوث اسماك الزرد لتوفير الرعاية الممتازة تربية الجارية لمستعمرة الزرد لدينا. يؤيد التمويل من منح الجائزة NIH - NIDDK DK083512 ، ومختبر السخي البدء بتمويل من جامعة نوتردام ، وهذا العمل.

1. Microinjection الداخلي لتسمية الزرد سليفة الكلوة القريبة ظهارة نبيب لهذا الإجراء ، ونحن نستخدم نظام microinjection (هارفارد Appartus ، PLI90) ، مع توفير الهواء المضغوط عن طريق ضاغط الهواء (يونيو الهواء ، نموذج 6-4) ، وأجهزة micromanipulator (Narishege أجزاء MN151 ، IP3 ، وGJI) التي يتم تجميعها في محطة stereomicroscope (نيكون ، SMZ التكبير 645) كما في تعليمات الشركة الصانعة. وتقارن ديكستران endocytosed بسهولة من قبل نبيب نفرون القريبة ، مما يتيح وضع العلامات التفضيلية لهذه الفئة من السكان الخلايا الظهارية 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن التعرض للزرقة الميثيلين إبراز تألق ذاتي من الكيس المحي ويجعل من التصور نفرون الأنابيب أكثر صعوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الأجنة المخصبة في 28.5 إلى timepoint التنموي بين 48-55 ساعة بعد الإخصاب (HPF) درجة مئوية. هذه هي المرحلة المثالية لأداء microinjections اليرقات بسبب سهولة التي يمكن أن يؤديها microinjection العضلي ، ولأن وظيفة الكلى يبدأ في هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي المشيماء من الزرد لم يفقس باستخدام زوج من ملقط الغرامة. شطف الحطام المشيماء من طبق بتري وإعادة ملء الطبق مع 30 مل من محلول تعديل E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد علبة الحقن للأجنة. يتم حقن القالب المفضل لدينا 1.5 ٪ agarose/E3 ، والتي تتشكل المنخفضات الثلاثي بحيث يمكن وضعه داخل الجنين عن طريق الحقن. لجعل حقن القالب ، ونحن تعويم قالب من البلاستيك مع نتوءات على شكل وتد (بالتفصيل 11 سابقا) في طبق بتري مليئة قاعدة agarose 1.5 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الإبر microinjection الزجاج عن طريق سحب الأنابيب الشعرية مع مجتذب الإبرة ، كما هو موضح في كتاب اسماك الزرد 10. باختصار ، سحب أنابيب زجاجية الشعرية ثم استخدم ملقط معدني غرامة لقطع رأس الإبرة microinjection لجعل غيض مع نقطة حادة أثناء عرض غيض إبرة تحت stereomicroscope. تخزين مغطاة بقطع الإبر في طبق بتري وضعه على الملاعب الرملية لحماية النمذجة حافة قطع ومنع تراكم الغبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الحقن لتسمية نبيب القريبة. حل 40 دينار ديكستران - فلوريسئين المتقارن (Invitrogen ، D1845) بتركيز 1 ملغ / مل في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتخدير الأسماك ، وإضافة 5 مليليتر من 0.2 درجة الحموضة 7.0 ٪ Tricaine إلى طبق بتري تحتوي على يرقات الزرد في 30 مليليتر من E3. الأسماك هي تخدير عندما لم يعد يحمل استجابة اللمس. فمن الأهمية بمكان أن يتم تخدير السمكة تماما أو أنها سوف تحاول نشل على ضخها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأسماك إلى حقنة تخدير علبة العفن باستخدام الماصة نقل من البلاستيك. موقف الحيوانات مع رئيسها في أعمق جزء من الاكتئاب الثلاثي جيدا ، وعلى جانبها بحيث يكون الجذع يستريح على طول الجانب من زاوية البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء microinjection العضلي. تحميل إبرة قطع 2-3 مع ميكرولتر من فلوريسئين دكستران ، وحقن الحيوان في الجسيدة الجذع مع ما يقرب من 1 NL من الحل. الهدف للجزء العلوي من الجسيدة ، وتجنب تمديد كيس المح. هذا يضمن أن لا يتم نبيبات نفرون تعطل ميكانيكيا بواسطة عملية microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الزرد لحقن طبق بتري نظيفة ، وإضافة محلول E3 تعديلها. شطف الحيوانات 3 مرات مع E3 جديدة لإزالة كل آثار Tricaine. تغطية غطاء طبق بتري مع رقائق الألومنيوم الخفيف لتوفير الحماية للدكستران ، والعودة إلى الحيوانات الحاضنة 28 درجة مئوية خلال الليل. </li></ol> 2. استهدفت التذرية الليزر من الخلايا القريبة نبيب لهذا الإجراء ، ونحن مع استخدام stereomicroscope epifluorescence ليسجل مع الحيوانات المنوية فلوريسئين ديكستران القريبة الزاهية التي تحمل علامات وحدد لهذه التذرية الليزر. ثم ، ونحن نستخدم ليزر نابض micropoint النظام (الآلات الضوئية ، المؤتمر الوطني العراقي) التي تم تركيبها على مجهر مركب (نيكون الكسوف 80i epifluorescent مع المرفقات) ، ومعايرة لاستخدامها في تعليمات الشركة الصانعة ، لأداء نفرون الاجتثاث الخلية. كان لدينا أكثر نجاحا في خلية التذرية باستخدام فلتر FITC التي تمكن الباحث لعرض المناطق تحت الإضاءة الفلورسنت نبيب brightfield. مقدما من هذا الإجراء ، وإعداد وسائل الاعلام لاجتثاث الشلل عن طريق إذابة methylcellulose 1.5 ٪ في tricaine/E3 0.02 ٪. aliquots مخزن للmethylcellulose للاستخدام الفوري في درجة حرارة الغرفة ، أو على 4 درجات مئوية على المدى الطويل التخزين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الزرد HPF بإضافة 5 72 مليليتر من 0.2 ٪ إلى 7.0 درجة الحموضة Tricaine طبق بتري تحتوي على يرقات الزرد في 30 مليليتر من E3. الأسماك هي تخدير عندما لم يعد يحمل استجابة اللمس. فمن الأهمية بمكان أن يتم تخدير السمكة تماما أو أنها سوف تحاول نشل على أداء التذرية الليزر. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الحيوانات حقنها تحت وضع الفلورسنت المناسب وحدد الحيوانات التي يمكنك بسهولة تصور الأنابيب القريبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة لاختيار طبق منفصل يحتوي tricaine. يمكن للحيوانات أن تخدير لمدة تصل إلى 30 دقيقة قبل تنفيذ الاجتثاث الخلية. إذا كنت النتيجة&gt; 15 الحيوانات ، والعودة إلى تلك التي تحتوي على صحن منفصل الطازجة E3 في انتظار تعديل الاجتثاث حيث أن كل خلية التذرية تستغرق عدة دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأداء التذرية ، نقل أحد الزرد لتخدير طبق بتري صغيرة تحتوي على 1.5 ٪ tricaine methylcellulose/0.02 ٪ لمدة 2 دقيقة لغسل الأجنة في وسائل الإعلام الشلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، ونقل الجنين الى الشريحة الزجاجية التي تحتوي على الاكتئاب بنسبة انخفاض قدرها 1.5 ٪ methylcellulose/0.02 tricaine ٪. موقف الحيوانات برفق مع لجنة التحقيق ان هذه الغرامة جانبها تواجه الشريحة البطنية والجانبية الظهرية يكون مواجها لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشريحة على المسرح compund المجهر ، والتركيز على الجانب الظهري من الحيوان. أداء الاقتلاع من الخلايا تحت نفرون التركيز بالضغط على دواسة القدم. سترى تشتت مضان كما هي الخلايا الكلوية ablated الظهارية (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحيوانات برفق ablated إلى بئر في صحن رفاه 12 لزراعة اللاحقة. شطف E3 2-3 مرات لغسل بعيدا methylcellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن ، ورفع الحيوان إلى timepoint المطلوب وإجراء التحليل المطلوب وفقا للوضع تقنيات النسيجية والجزيئية للأجنة الزرد الشباب (الشكل 2). </li></ol> 3. ممثل النتائج : البيانات التي تظهر في الشكل 1 يبين timecourse الاجتثاث. بعد الحقن العضلي مع ديكستران - تقارن ، هو المسمى تفضيلي نبيب القريبة. تم استخدام حقن ديكستران - FITC لتسمية الكلى للالتذرية الليزر ، وكان يعاد ضخ الحيوانات ablated مع ديكستران - رودامين في أحد الاجتثاث timepoint الإضافية التالية لreimage السكان نبيب القريبة. ويمكن استخدام تقنيات تحليل التعبير في مثل تهجين الموقع لتحليل التغييرات في عينات ثابتة في timepoints احد الاجتثاث الخلية التالية ، كما هو مبين في الشكل 2. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1 : ويتبع الإجراء الليزر التذرية التي التجديد السريع للظهارة نبيب (AC) Timecourse التغيرات الخلوية أثناء وبعد الاستئصال بالليزر نبيبات اليرقة الزرد الداني في وقت الاجتثاث (يوم 3 ، لوحة أ) ، أو واحد أو ثلاثة. آخر أيام التذرية (يوم 4 ، لوحة باء ؛ يوم 7 ، لوحة C). (الأعلى) تظهر الرسومات موقف نفرون ، مع ديكستران - FITC (الخضراء) وديكستران رودامين - (الحمراء) ، و (القاع). الصور الحية عن السيطرة والليزر ablated النيفرون (لوس انجليس) <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2 : تحليل الجينات التعبير التالي التذرية الليزر التذرية الليزر على بعد 3 أيام ، كانت ثابتة الأجنة ومعالجتها بواسطة جبل بأكمله في الموقع التهجين للكشف عن النصوص slc20a1a التي بمناسبة الدانية الجزء نبيب الملتوية للنفرون. (أ) الجنين السيطرة التي كانت لا تخضع لالتذرية الليزر ، (B) في جنين الذي كان ablated مساحة كبيرة من ظهارة أنبوبية ، و (C) في جنين الذي كان ablated فاصل زمني قصير من ظهارة نبيب. الخط الأسود يدل على مدى نبيب والداني في تقديم خدمات مرجعية والخطوط الزرقاء تدل على مدى التذرية الليزر في الألواح قبل الميلاد ، ويدل على سيطرة * (غير ablated) نفرون المقابل في لوحات ق.

<ol>
	<li>Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure.">Acute renal failure.</a> New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).</li><li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+and+proliferation+of+surviving+epithelial+cells+in+acute+renal+failure.">Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure.</a> J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+kidney+development.">The cellular basis of kidney development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).</li><li>Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).</li><li>Cosentino, C. i. a. n. c. i. o. l. o., Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+to+Study+Acute+Kidney+Injury.">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).</li><li>Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+zebrafish+pronephros+and+analysis+of+mutations+affecting+pronephric+function.">Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function.</a> Development. 125, 4655-4657 (1998).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).</li><li>Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury.">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li><li>Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+stem+cells+to+kidney+repair.">Contribution of stem cells to kidney repair.</a> Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).</li><li>Devarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+mechanisms+of+ischemic+acute+kidney+injury.">Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kid. Int. , (2010).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

والزرد هو كائن النموذج المستخدم على نطاق واسع في جميع أنحاء العديد من جوانب العلم ، والتطبيقات التي تنمو 6. وقد أدى توظيف في النظام النموذجي الزرد في دراسة أمراض الكلى مثل الفشل الكلوي الحاد على الملاحظات الهامة وسوف تستمر في أن تكون نموذجا جيدا لدراسة إصابة الكلى 7،8. مع الجينوم الذي تم التسلسل والبروتوكولات الجزيئية كثيرة في المكان ، أصبح من السهل على نحو متزايد لتنفيذ البحوث المتطورة التي تستخدم الزرد النماذج المعدلة وراثيا ، ضربة قاضية الجينات ودراسات misexpression. والزرد لديه دورة حياة قصيرة مع الأحجام الكبيرة وجيل محددة جيدا المراحل التنموية. وعلاوة على ذلك ، والمراحل الجنينية الزرد واليرقات وشفافة إلى حد كبير ، مما يجعل دراسات التصوير ممكنا من دون تشريح للكائن. طوال المراحل الجنينية واليرقات ، والزرد والكلى سليفة تتألف من اثنين من النيفرون ، التي تبقى واضحة خلال هذه timepoints التنموية. الزرد النيفرون سليفة هي مشابهة في التركيب والوظيفة لنظرائهم من الثدييات ، مما يجعلها نموذجا جيدا للدراسات الفشل الكلوي الحاد 4،5. الكلى أمر حاسم لبقاء البشر والفقاريات الأخرى ، بوصفه الجهاز الذي يطهر الجسم من النفايات السائلة الأيض. هذه المهمة تقع على التطهير قدرة النيفرون الكلى لتصفية الدم ، ومن ثم تعديل رشاحة يقوم بجمع النفايات النتروجينية لإفراز والحفاظ في نفس الوقت توازن السوائل والكهارل. وتتألف النيفرون لتصفية الدم ، أنبوبية الظهارية ، وتصب في قناة و. السلامة الهيكلية والوظيفية لجميع الأجزاء الثلاثة جزء لا يتجزأ من وظيفة نفرون. يمكن الشتائم المختلفة إلى الكلى ، بما في ذلك التعرض للnephrotoxins ، نقص التروية ، أو عرقلة تدفق البول نتيجة مساحات في AKI 1. وكثيرا ما يرتبط في علم الأمراض من AKI مع 1،2 نخر أنبوبي حاد. وقد أظهرت الدراسات السريرية التي تلت ذلك الفشل الكلوي لديها معدل وفيات الأطفال التي يمكن أن تتراوح في أي مكان 7-80 ٪ اعتمادا على سبب وسياق الفشل الكلوي. ومع ذلك ، يرتبط على نحو متزايد التشخيص السريع وعكس السبب الكامن وراء الانتعاش مع AKI عبر تجديد نبيبات نفرون نخرية. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن تعيين مصير السكان الخلية الرئيسية التي repopulates نبيبات نفرون معطوبة الخلايا الظهارية التي تنشأ من المناطق المجاورة لم يصب 12. هذه النتائج لم تكن قد قضت على احتمال أن الكلوي الجذعية / السلف الخلايا يمكن أن تشارك في هذه العملية ، وتقارير مستقلة اشارت الى ان خلايا نخاع العظام المستمدة يمكن أن تسهم في تجديد الكلوي 13. فمن الواضح أن هناك حاجة لاستمرار التحقيقات في حل أفضل مصادر التجدد الخلوي الظهارية الكلوية. كلا نفرون التجدد والتنمية حصة ظاهرة تبديل في ولاية الخلوية بين الظواهر الوسيطة والظهارية. أثناء تطوير نفرون ، وخلايا اللحمة المتوسطة السلف التمايز إلى النمط الظاهري ثابتة ، لربط الغشاء القاعدي لتشكيل الظهارة الأنبوبية 3. وتكهنت ظاهرة هجرة الخلايا الظهارية في أعقاب فشل كلوي حاد يستوجب فقد التمايز إلى النمط الظاهري الوسيطة. ومن المثير للاهتمام ، فإن الدراسات الحديثة تشير الى ان خلايا اللحمة المتوسطة في الكلى التالفة يحمل ملف تعريف التعبير مماثلة إلى خلية الوسيطة خلال التنمية 14. وقد كشفت تقارير مختلفة التغييرات في خلية التصاق جزيئات البروتينات المصفوفة ، والسيتوكينات chemokines. بعد الوسيطة المقترحة للانتقال الظهارية وخلايا يحشدوا على الغشاء القاعدي ومعاودة نشاطات الظهارية الأنبوبية. تحديد الجينات المهم في هذه العملية لا تزال موضوعا للبحث عن المختبر وغيرها. الكثير من العمل لتوضيح العوامل الرئيسية في هذه العملية لا يزال يتعين القيام به ، ولكن تم بشرت تقدما كبيرا في المجال من خلال دراسة آثار الجنتاميسين. AKI والفشل الكلوي الناجم عن جنتاميسين وثيق الصلة بالنظر إلى انتشار مجمعات كلى تستخدم في الطب 15. تستخدم كعلاج للسالبة الجرام الالتهابات البكتيرية ، وإقامة الأمينوغليكوزيد يؤدي الى الاصابة الحادة في 10-25 ٪ من الحالات. هذا الدواء يسبب مجموعة كبيرة من الآثار السلبية الخلوية ، مما أدى إلى موت الخلايا المبرمج معا أو نخر في خلايا أنبوبية عديدة. وقد وجدت الدراسات المخدرات لربط تفضيلي لمجمع شكلتها megalin cubulin والتي تشارك في الإلتقام. تم العثور على هذه الجزيئات في وفرة في الخلايا الظهارية للنبيب القريبة ، على الرغم من أنها لا تقتصر على التعبير في هذه الخلايا. من خلال الإشارات الخلوية مما أدى إلى تحريض الاكسدة ، وإطلاق سراح vasoconstrictors ، ونضوب ATP الخلوية ، ونقص الأكسجين ، وتثبيط phospholipases ، والمضادات الحيوية وجنتاميسين تسبب مماثلةموت الخلايا المبرمج ونخر في الخلايا الظهارية. بالإضافة إلى ذلك ، والمضادات الحيوية يؤدي الانكماش مسراق الكبيبة في تصفية الدم نفرون (الكبيبة) ، مما أدى إلى انخفاض في معدل الترشيح الكبيبي وتغيير سلبا على قدرة الكلى على تصفية الدم. إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية ، والجزيئات immunostimulatory ، وتفعيل phospholipases آثار منتشر في نفرون ، وخلق أمراض الكارثية التي تؤدي إلى فشل كلوي حاد. في حين أن دراسات مشابهة للمضادات الحيوية والجنتاميسين كانت وستظل أدوات مهمة للبحوث التجديد الكلى ، وأنها تفتقر إلى الدقة التي يمكن أن تكون مفيدة في معالجة بعض المسائل. نظامنا باستخدام الزرد بالتزامن مع الليزر التذرية طريقة المبينة في هذا البروتوكول يجيب على الحاجة لمثل هذا أداة بحث دقيقة. الليزر التذرية يسمح للباحثين للحث على تدمير خلايا في المناطق المحورية للنبيب كلوي ، بدءا من الصغيرة (2-3) إلى السكان (&gt; 5-10) كبير ، مع دقة لا تضاهى. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم طريقة تم تطويرها من قبل التعرض لديكستران - تقارن تفضيلي لتسمية السكان نبيب القريبة الظهارية. بدلا من ذلك ، يمكن أن تستخدم خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء في واحدة أو أكثر من المناطق نبيب. على سبيل المثال ، cadherin17 : eGFP المعدلة وراثيا يحمل الزرد مضان قوي في المناطق البعيدة نبيب (على الرغم من ضعف في السكان القريبة) ، ويمكن أن تكون ذات قيمة للدراسات التجديد في قطاعات أخرى نبيب 16. سيتم تسليط الضوء على تمكين نفرون الوقت الفاصل بين تسجيل الفيديو من التغيرات الخلوية مع مرور الوقت. عندما يقترن دراسات التعبير الجيني مثل جبل بأكمله في الموقع التهجين أو المناعية ، يمكن للباحثين الكشف عن التغيرات الجزيئية في نفرون مع مرور الوقت. أخذت معا ، يمكن أن تبدأ مثل هذه الاستراتيجيات لصياغة فهم أكثر ديناميكية من الأحداث التي ترشح عندما يتم تدمير الخلايا الظهارية الكلوية. التحذير الرئيسية لدينا نموذج الليزر التذرية هي أنه قد ألخص جوانب جزئية من الظروف الفسيولوجية التي ترشح في AKI الإنسان. وفاة الخلية من خلال الأضرار المادية الناجمة عن حظية يختلف عن سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى نخر في الخلايا ، وعلى هذا النحو العوامل الخلطية في هذه microenvironments مختلفة قد لا تكون متطابقة. بالإضافة إلى ذلك ، توجد أدلة على موت الخلايا المبرمج بفعل الاصابة خلال الكلى ، وليس من المعروف ما إذا كانت هذه الآثار ارشح إهانة التالية مع الليزر. ومع ذلك ، تماما كما خلية ثقافة هو أداة أفضل إجابات بعض الأسئلة التي تتطلب بيئة محكومة إلى حد كبير ، التذرية الليزر ستكون بمثابة رقابة شديدة A في الجسم الحي من طراز AKI. على هذا النحو ، حصل على رؤى من الدراسات الكلوي الاجتثاث الظهارية في الزرد سيعزز احتمال اكتشاف الأفكار الأساسية التي يمكن تطبيقها على التحقيقات عن وقوع اصابات الكلوي الأخرى والتي يحتمل استخدامها لخلق أفضل التشخيص لدى البشر.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> جنين الأطباق </td><td> صقر </td><td> 35-1005 </td></tr><tr><td> تشريح ملقط </td><td> Roboz </td><td> RS - 5010 </td></tr><tr><td> حقن الابر </td><td> سوتر Intruments </td><td> BF100 - 50-10 </td></tr><tr><td> عالى النقاء agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 40 kilodalton (دينار) ، ديكستران فلوريسئين </td><td> Invitrogen </td><td> D1845 </td></tr><tr><td> البلاستيك نقل الماصة </td><td> سامكو العلمية وفيشر </td><td> 204 ، 13-711-23 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> سيغما </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> سيغما </td><td> M0262 </td></tr><tr><td> الاكتئاب الشريحة </td><td> الصياد </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> 12 طبق جيدا </td><td> كورنينج </td><td> 3512 </td></tr></tbody></table>

laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration

يتميز إصابة الكلى الحاد (كونا) عن طريق ارتفاع معدلات الوفيات من تدهور وظائف الكلى على مدى ساعات أو أيام والذي يبلغ ذروته في الفشل الكلوي 1. يمكن أن يكون سبب الفشل الكلوي الحاد من جانب عدد من العوامل من بينها نقص التروية سمية الدواء ومقرها ، أو إصابات معوقة 1. هذه النتائج في عدم القدرة على الحفاظ على توازن السوائل والكهارل. في حين لوحظ AKI لعقود ، والعلاجات السريرية فعالية ما زال يتعين تطويرها. يثير الاهتمام والفضول ، وبعض المرضى الذين يعانون من استعادة وظائف الكلى آكي مع مرور الوقت ، وهي ظاهرة الغامضة التي تم rudimentally تتميز فقط 1،2. وقد أظهرت الأبحاث باستخدام نماذج من الثدييات AKI أن نقص تروية الكلى أو جرح ، nephrotoxin تجربة موت الخلايا الظهارية في نبيبات نفرون 1،2 ، وحدات وظيفية في الكلى التي تتكون من سلسلة من المناطق المتخصصة (شرائح) من أنواع الخلايا الظهارية 3 . في غضون النيفرون ، موت الخلايا الظهارية هو أعلى في الخلايا نبيب القريبة. هناك أدلة توحي بأن يتبع تدمير الخلية فقد التمايز ، والانتشار ، وهجرة الخلايا الظهارية المحيطة بها ، والتي يمكن تجديدها بالكامل نفرون 1،2. ومع ذلك ، هناك الكثير من علامات الاستفهام حول آليات التجديد الظهارية الكلوية ، بدءا من الاشارات التي تعدل هذه الأحداث لأسباب الاختلاف واسعة من القدرات بين البشر لتجديد الكلى الجرحى. والزرد اليرقات يقدم نموذجا ممتازا لدراسة تجديد الكلى الظهارية ويتكون من الكلى لسليفة النيفرون التي يتم حفظها مع ارتفاع 4،5 الفقاريات بما فيها الثدييات. يمكن لليرقات النيفرون الزرد يمكن تصور مع تقنيات مضان بسبب الشفافية النسبية للالزرد الشباب 6. وهذا يوفر فرصة فريدة لخلية الصور والتغيرات الجزيئية في الوقت الحقيقي ، على النقيض من نماذج الثدييات النيفرون حيث لا يمكن الوصول إليها بسبب الكلى والنظم المعقدة هيكليا منضوية تحت لواء الحيوانية. استخدمت الدراسات التي أجريت مؤخرا في جنتاميسين أمينوغليكوزيد كوكيل أعمال للالسامة المسببة لدراسة آكي والفشل الكلوي لاحقا : لقد ثبت جنتاميسين والمضادات الحيوية الأخرى لسبب AKI في البشر ، والباحثين قد وضعت وسائل لاستخدام هذا العامل لتحريك تلف الكلى في الزرد 7 (8). ومع ذلك ، فإن التأثيرات السمية أمينوغليكوزيد اليرقات في الزرد كارثية وقاتلة ، مما يشكل صعوبة عند دراسة تجديد الظهارية وظيفة مع مرور الوقت. أسلوبنا يعرض استخدام الاجتثاث الخلية المستهدفة كأداة لدراسة الرواية الإصابة الظهارية في الزرد. الليزر التذرية يعطي الباحثين القدرة على إحداث موت الخلايا في مجموعة سكانية محدودة من الخلايا. يمكن استهداف مناطق مختلفة من الخلايا بناءا على الموقع الصرفية ، وظيفة ، أو حتى التعبير عن النمط الظاهري خلوي معين. وبالتالي ، فإن الاقتلاع بالليزر زيادة خصوصية ما يمكن للباحثين دراسة ، ويمكن أن يكون طريقة فعالة جديدة لتسليط الضوء على آليات التجدد الظهارية الكلوية. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع لاستهداف السكان الخلية في الأجهزة الأخرى في الجنين الزرد لدراسة الإصابات والتجدد في أي عدد من سياقات الفائدة.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration at JoVE.com

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

إصابة الكلى الحاد (كونا) في البشر مشكلة شائعة السريرية الناجمة عن الأضرار التي لحقت الخلايا الظهارية التي تشكل النيفرون الكلى ، ويرتبط آكي مع ارتفاع معدلات الوفيات من 50-70 ٪<sup&gt; 1</sup&gt;. بعد تدمير الخلايا الظهارية ، النيفرون لديهم قدرة محدودة على التجدد ، على الرغم من تبقى غير مفهومة تماما الآليات والقيود التي توجه هذه الظاهرة. في هذه المقالة الفيديو ، ونحن لدينا وصف تقنية الليزر التذرية التي تستهدف خلايا الكلى نفرون في الكلى الجنين الزرد ، أو سليفة الكلوة. يمكن استخدام الأسلوب الجديد لاستكمال الكلوي الناجم عن النماذج من AKI ، واكتساب فهم عالية الدقة من الخلية والتعديلات الجزيئية التي ترتبط مع التجدد الظهارية في نفرون الكلوي.

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

قشري الخلايا العصبية : الانتقال من التقدم في مختبر لخلية القاعدة العلاجات

Computer-Generated Animal Model Stimuli

الحاسوب خلق المحفزات الحيوان النموذجي

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Murine Renal Transplantation Procedure

فأري إجراء زراعة الكلى

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

طرق لدراسة بربل الفكين اسماك الزرد

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

باستخدام optokinetic استجابة لدراسة وظيفة البصرية من الزرد

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...