Name: laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration
Uploaded: 2011-08-29T13:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration at JoVE.com

Biz, onun metilselüloz tarifi paylaşımı için yararlı AKI biyoloji ve zebrafish teknikleri tartışmaları ve C. Diep için Wingert laboratuar üyelerine teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca, Zebra balığı koloni için mükemmel devam eden hayvancılık bakım sağlamak için Zebra balığı Araştırma Notre Dame Merkezi personeli için şükranlarımızı ifade etmek istiyoruz. Notre Dame Üniversitesi&#39;nden start-up finansman NIH-NIDDK hibe DK083512 ve cömert bir laboratuar, fon, bu çalışmaları destekledi.

1. Mikroenjeksiyon işlemi zebrafish etiket proksimal tübül epitel pronephros Bu işlem için, biz olduğu bir hava kompresörü (Haz-Air, Model 6-4) ve mikromanipülatör aparat (Narishege parçalar MN151, IP3 ve GJI) tarafından sağlanan basınçlı hava ile mikroenjeksiyon sistemi (Harvard Appartus, PLI90) üreticinin talimatına göre stereomikroskopta istasyonu (Nikon SMZ-Zoom 645) toplandı. Dextran&#39;ın konjugatları kolayca bu epitel hücre nüfusu 9 tercihli etiketleme sağlayarak, nefron proksimal tübül endocytosed. <ol><li> Metilen mavisi maruz kalma yolk kesesi otofloresans önemle ve nefron görselleştirme, daha zor tübüller hale getirir. </li><li> 28.5 döllenmiş embriyolar kaldırın ° C 48-55 saat sonra döllenme (hpf) arasında bir gelişim timepoint. Bu intramüsküler mikroenjeksiyon yapılabilir hangi kolaylığı nedeniyle larva microinjections gerçekleştirmek için ideal bir aşamasıdır ve böbrek fonksiyon çünkü şu anda başlar. </li><li> Bir çift güzel forseps kullanarak herhangi bir çıkmamış zebrafish koryon çıkarın. Koryon enkaz petri ve dolum tabak modifiye E3 çözüm 30 mL ile durulayın. </li><li> Embriyoların bir enjeksiyon tepsi hazırlayın. Bizim tercih enjeksiyon kalıp, üçgen depresyonlar embriyo enjeksiyon için içine yerleştirilmiş olabilir oluşan,% 1.5 &#39;agarose/E3 yapılır. Enjeksiyon kalıp yapmak için,% 1.5 agaroz bir taban ile dolu bir Petri kabındaki kama şeklinde çıkıntılar (daha önce 11 ayrıntılı olarak açıklanmıştır) ile plastik kalıp süzülüyor. </li><li> Zebra balığı Kitap 10 açıklandığı gibi, bir iğne çektirmesi ile kılcal tüpler çekerek cam mikroenjeksiyon iğneler hazırlayın. Kısacası, kılcal cam tüpler daha sonra stereomicroscope altında iğne ucu izlerken mikroenjeksiyon iğne ucu sivri bir ucu ince metal kesmek için forseps kullanabilir çekin. Petri kaplı kesme ve kesme kenarı korumak ve toz birikmesini önlemek için kil modelleme üzerinde konumlandırılmış iğneler saklayın. </li><li> Proksimal tübül etiket enjeksiyon solüsyonu hazırlayın. Distile su içinde 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon 40 kD dekstran-floresein konjuge (Invitrogen, D1845) eritin. </li><li> Balık uyutmak için% 0.2 Tricaine pH 7,0 5 mL, 30 mL E3 Zebra balığı larvaları içeren petri ekleyin. Artık dokunmatik tepki gösterirler, balık anestezi. Bu balıklar tamamen anestezi ya da enjekte çalışırken üzerine seğirme hayati önem taşımaktadır. </li><li> Anestezi balık, plastik transferi pipetlemeyin kullanarak bir enjeksiyon kalıp tepsiye aktarın. Iyi ve iyi açılı yan gövde boyunca dinlenme olduğu gibi yan üçgen depresyon en derin kısmında baş hayvan yerleştirin. </li><li> Intramüsküler mikroenjeksiyon gerçekleştirin. Dekstran floresein 2-3 mcL bir kesim iğne yerleştirin ve çözüm yaklaşık 1 nL bir gövde hücre gruplarının hayvan enjekte. Amaç, hücre gruplarının üst kısmı için ve yolk sac uzatma kaçının. Bu nefron tübüller mekanik mikroenjeksiyon işlemi tarafından kesintiye olduğunu sağlar. </li><li> Enjekte zebrafish temiz bir petri kabına aktarın ve modifiye E3 çözüm ekleyin. Tricaine tüm izlerini kaldırmak için taze E3 hayvanlar 3 kez durulayın. Dekstran ışık koruma sağlar ve bir gecede 28 ° C inkübatör hayvanların dönmek için alüminyum folyo ile petri kapağını örtün. </li></ol> 2. Proksimal tübül hücrelerinin Hedeflenen lazer ablasyon Bu işlem için, Epifloresans ile stereomikroskopta dekstran floresein parlak etiketli proksimal tübüller hayvan skoru ve lazer ablasyon için bu seçmek için kullanın. Sonra, bir bileşik mikroskop (Nikon Eclipse 80i epifluorescent eki ile) bağlı kullanımı için üreticinin talimatına göre kalibre, nefron hücre ablasyon gerçekleştirmek olmuştur darbeli micropoint lazer sistemi (Fotonik Instruments, Inc.) Kullanın . Biz aydınlık ışık altında floresan tübül bölgeleri görmek için araştırmacı sağlayan bir FITC filtresi kullanarak hücre ablasyonu en başarılı oldu. Bu prosedür öncesinde,% 1,5% 0,02 tricaine/E3 metilselüloz eriterek ablasyon için immobilizasyon medya hazırlar. Oda sıcaklığında hemen kullanımı için metilselüloz Mağaza bölüntülerin veya 4 ° C, uzun süreli depolama için. <ol><li> E3 30 mL Zebra balığı larvaları içeren petri 5 mL% 0.2 Tricaine pH 7.0 ekleyerek 72 hpf zebrafish anestezisi. Artık dokunmatik tepki gösterirler, balık anestezi. Bu balıklar tamamen anestezi ya da lazer ablasyon gerçekleştirmek için çalışırken üzerine seğirme hayati önem taşımaktadır. </li&gt; <li> Enjekte edilen hayvanların uygun floresan ayarı altında inceleyin ve kolayca proksimal tübüller görselleştirmek hangi hayvanlar seçin. </li><li> Tricaine içeren ayrı bir çanak seçilen embriyolar transfer. 30 dakika kadar hücre ablasyon gerçekleştirmeden önce Hayvanlar anestezi olabilir. &gt; 15 hayvanların puan, her bir hücre ablasyon birkaç dakika sürer gibi ablasyon beklerken taze değiştirilmiş E3 içeren ayrı bir kapta bu dönün. </li><li> Ablasyon gerçekleştirmek için, immobilizasyon medya embriyo yıkamak için 2 dakika süreyle% 1.5 methylcellulose/0.02% tricaine içeren küçük bir petri bir anestezi zebrafish aktarın. </li><li> Sonra, bir damla% 1.5 methylcellulose/0.02% tricaine içeren bir cam depresyon slayt embriyo transferi. Ventral tarafta slayt ve dorsal yüzü yukarı bakacak karşı karşıya olduğu gibi ince bir sonda ile hayvan yavaşça yerleştirin. </li><li> Bitişik mikroskop sahnede slayt yerleştirin ve hayvan dorsal tarafına odaklanmak. Ayak pedalına basılarak odak altında nefron hücrelerinin ablasyon gerçekleştirin. Renal epitel hücreleri (Şekil 1A) ablasyon olarak floresan dağılma göreceksiniz. </li><li> Yavaşça sonraki kültür için 12 iyi yemek, iyi bir ablasyon hayvan transfer. Metilselüloz yıkayacak E3 2-3 kez durulayın. </li><li> Enjeksiyondan sonra, istenilen timepoint hayvan yükseltmek ve genç zebrafish embriyolar (Şekil 2) için kurulan histolojik ve moleküler teknikler başına istediğiniz gibi analiz,. </li></ol> 3. Temsilcisi sonuçları: Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi veri ablasyon timecourse göstermektedir. Dekstran-konjugatları ile intramüsküler enjeksiyondan sonra, proksimal tübül tercihen etiketlenir. Dekstran-FITC enjeksiyon, lazer ablasyon için böbrek etiketlemek için kullanılmış ve ablasyon hayvanlar proksimal tübül nüfus Reimage bir ek timepoint aşağıdaki ablasyon dekstran-rodamin reinjected. İfade analiz teknikleri, in situ hibridizasyon gibi Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi hücre ablasyon tek timepoints değişiklikler, sabit örnekleri analiz etmek için kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1: Lazer ablasyon tübül epitel hızlı rejenerasyon (AA) sırasında hücresel değişikliklerin Timecourse ve ablasyon (3. gün, panel A) Zebra balığı larva proksimal tübüller lazer ablasyon sonraki ya da bir veya üç. gün ablasyon (günde 4 B, panel, gün 7, panel C). (Üst) şemadaki dekstran-FITC (yeşil) ve dekstran-rodamin (kırmızı), nefron konumu ve (alt) kontrolü ve lazer ablasyon (LA) nefron canlı görüntüler. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2: lazer ablasyon gen ekspresyon analizi 3 gün lazer ablasyon sonra, embriyolar Nefron proksimal tübül segmentinde işareti dolambaçlı slc20a1a, transkript algılamak için sabit ve in situ hibridizasyon bütün montaj tarafından işlendi. (A) lazer ablasyon tabi değildi kontrol embriyo, (B) tübül epitel büyük bir streç ablasyon, ve (C) olan bir embriyo tübül epitel kısa bir zaman aralığı ablasyon edildiği bir embriyo. Siyah çizgi referans sağlamak için proksimal tübül miktarını gösteren, mavi çizgiler panelleri M.Ö. lazer ablasyon ölçüde göstermektedir * (ablasyon) kontrol panelleri M.Ö. kontralateral nefron gösterir.

<ol>
	<li>Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure.">Acute renal failure.</a> New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).</li><li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+and+proliferation+of+surviving+epithelial+cells+in+acute+renal+failure.">Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure.</a> J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+kidney+development.">The cellular basis of kidney development.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).</li><li>Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+pronephros:+a+model+to+study+nephron+segmentation.">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).</li><li>Cosentino, C. i. a. n. c. i. o. l. o., Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+to+Study+Acute+Kidney+Injury.">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).</li><li>Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+zebrafish+pronephros+and+analysis+of+mutations+affecting+pronephric+function.">Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function.</a> Development. 125, 4655-4657 (1998).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2000).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).</li><li>Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+epithelial+cells+repair+the+kidney+after+injury.">Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury.</a> Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).</li><li>Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+stem+cells+to+kidney+repair.">Contribution of stem cells to kidney repair.</a> Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).</li><li>Devarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+mechanisms+of+ischemic+acute+kidney+injury.">Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kid. Int. , (2010).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Zebra balığı pek çok bilim yönleriyle boyunca yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır, uygulamalar 6 büyüyor. AKI gibi böbrek hastalıkları çalışmada zebrafish model sistem istihdam önemli gözlemler yol açmıştır ve böbrek yaralanması 7,8 incelemek için iyi bir model olmaya devam edecektir. Bir sıralı olmuştur genom ve yerine birçok moleküler protokolleri ile, transgenik modelleri, gen demonte ve misexpression çalışmaları kullanan sofistike zebrafish araştırma gerçekleştirmek için giderek daha kolay hale gelmiştir. Zebra balığı, büyük üretim boyutları ve iyi tanımlanmış bir gelişim evreleri ile kısa bir yaşam döngüsü vardır. Ayrıca, organizmanın diseksiyonu olmadan zebrafish embriyonik ve larva aşamaları görüntüleme çalışmaları mümkün kılan büyük ölçüde şeffaf. Embriyonik ve larva aşamaları boyunca, Zebra balığı, bu gelişim timepoints sırasında görünür kalmasını iki nefron, oluşan bir pronephric böbrek vardır. Zebra balığı pronephric nefron 4,5 akut böbrek yetmezliği çalışmaları için iyi bir model, memeli meslektaşları yapısı ve fonksiyonu ile benzerdir. Böbrek, vücut sıvı metabolik atıkların temizler organı olarak hizmet veren, insan ve diğer omurgalıların hayatta kalması için çok önemlidir. Bu temizlik fonksiyonu, böbrek nefron kan filtre ve sonra süzüntü değiştirmek salgılanması için azotlu atıkları toplamak ve aynı anda sıvı ve elektrolit dengesini korumak yeteneğine dayanmaktadır. Nefron bir kanal içine kan filtresi, epitel tübül ve drenaj oluşmaktadır. Üç parça yapısal ve işlevsel bütünlüğü nefron fonksiyon ayrılmaz bir parçasıdır. Nephrotoxins maruz kalma, iskemi veya idrar çıkış yolları tıkanıklığı da dahil olmak üzere böbrek çeşitli hakaretler, AKI 1 neden olabilir. AKI, patoloji genellikle akut tübüler nekroz 1,2 ile ilişkilidir. Klinik çalışmalar, takip eden böbrek yetmezliği, böbrek yetmezliği nedeni ve bağlam bağlı olarak,% 7-80 yerden arasında olabilir bir ölüm oranına sahip olduğunu göstermiştir. Ancak, AKI altında yatan neden hızlı tanı ve ters gittikçe nekrotik nefron tübüller rejenerasyon yoluyla kurtarma ile ilişkilidir. Son kaderi haritalama çalışmaları, hasar nefron tübüller doldurur büyük hücre popülasyonu bitişik, yaralanmamış bir şekilde alanlarda 12 kaynaklanan epitel hücreleri olduğunu göstermiştir . Bu bulgular, böbrek kök / progenitör hücrelerin sürecine katılmak ihtimalini ortadan kalkmaz ve bağımsız raporlar kemik iliği kökenli hücreler böbrek rejenerasyon 13 katkıda bulunabileceğini ileri sürmüşlerdir. Bu, devam eden soruşturma renal epitelyal rejenerasyon hücresel kaynakları daha iyi çözmek için gerekli olduğu açıktır. Nefron yenilenme ve geliştirme payı mezenkimal ve epitelyal fenotipleri arasındaki hücresel devlet anahtarları fenomen. Nefron gelişimi sırasında, mezenkimal progenitör hücreler bazal membran bağlama, tübüler epitelyum 3 oluşturmak için sabit bir fenotip farklılaşırlar. Akut böbrek yetmezliği epitel hücreleri speküle göç fenomeni mezenkimal fenotip içine dediferansiyonunu gerektirir. İlginçtir, son yıllarda yapılan çalışmalarda, hasarlı böbreklerde mezenkimal hücreler, mezenkimal hücre gelişimi 14 sırasında benzer bir ifade profil sergileyen öneririz. Çeşitli raporlar, hücre adezyon molekülleri, matriks proteinleri, sitokinler ve kemokinleri değişiklikler tespit ettik. Epitel geçiş için önerilen mezenkimal hücreler bazal membran yenilemek ve tübüler epitel faaliyetleri yeniden başlatmak. Bu süreçte önemli olan genlerin belirlenmesi, laboratuar ve diğerleri için bir araştırma konusu olmaya devam ediyor. Bu süreçte en önemli faktörlerden aydınlatmak için çalışma yapılacak kalır, ancak bu alanda önemli bir ilerleme gentamisin etkilerini çalışma habercisi olmuştur. Gentamisin tarafından neden AKI ve böbrek yetmezliği, 15 tıp içinde kullanılan nefrotoksik bileşiklerin yaygınlığı dikkate alındığında, ilgili . Gram-negatif bakteriyel enfeksiyonlar için bir tedavi olarak kullanılır, aminoglikozidler idaresi olguların% 10-25 oranında akut yaralanma açar. Ilaç birlikte birçok tübüler hücrelerde apoptozis veya nekroz ile sonuçlanan bir bolluk, negatif hücresel etkileri neden olur. Çalışmalar megalin ve endositoz yer. Cubulin oluşturduğu karmaşık bir tercihen bağlamak için ilaç bulduk. Bu moleküller, bu hücrelerin ifade sınırlı olmadığı halde, proksimal tübül epitel hücrelerinde bol miktarda bulunur. Indüksiyon oksidatif stres, vazokonstriktörlere serbest bırakılması, hücresel ATP, hipoksi tükenmesi, fosfolipaz inhibisyonu sonucu hücresel sinyal sayesinde, gentamisin ve benzeri antibiyotikler nedenepitel hücrelerinde apoptozis ve nekroz. Ayrıca, antibiyotikler, glomerüler filtrasyon hızı bir düşüş nefron kan filtresi (glomerulus) mezanjiyal daralma tetikler ve kan dolaşımına filtre böbrek yeteneğini olumsuz yönde değiştirerek. Reaktif oksijen türleri, immünostimulan moleküller ve fosfolipaz aktivasyonu üretim, akut böbrek yetmezliğine yol açan bir felaket patoloji oluşturmak nefron diffüz etkileri vardır. Gentamisin ve benzer antibiyotik çalışmalar var ve böbrek rejenerasyon araştırma için önemli bir araç olmaya devam ederken, bazı sorulara yanıt yararlı olabilir hassas bir eksikliği. Sistemimiz, bu protokolü açıklanan bir lazer ablasyon yöntemi ile birlikte zebrafish kullanarak, böyle kesin bir araştırma aracı ihtiyaca cevap vermektedir. Lazer ablasyon araştırmacılar arasında değişen odak alanlarda böbrek tübül hücre yıkımını uyarmaz, küçük bir rakipsiz hassasiyet ile büyük (50-100) nüfus, (2-3). Bu protokol, tercihen proksimal tübül epitel popülasyonları etiket dekstran-konjugatları maruz kalma, daha önce geliştirilmiş bir yöntem kullanmaktadır. Alternatif olarak, bir veya daha fazla tübül bölgelerde yeşil flüoresan protein ifade transgenik zebrafish hatları kullanılabilir. Örneğin, cadherin17: eGFP transgenik zebrafish (proksimal popülasyonları da olsa zayıf) distal tübül bölgelerde güçlü floresan sergi ve diğer tübül segmentlerinde rejenerasyon çalışmaları 16 için değerli olabilir. Nefron görünürlüğü zaman içinde hücresel değişiklikler zaman atlamalı video kayıt sağlayacaktır. In situ hibridizasyon veya immünohistokimya bütün montaj gibi gen ekspresyon çalışmaları ile birleştiğinde, araştırmacılar zamanla nefron moleküler değişiklikler tespit edebilir. Birlikte ele alındığında, bu tür stratejiler böbrek epitel hücreleri yok edilir sızmak olayların daha dinamik bir anlayış formüle etmeye başlayabilirsiniz. Lazer ablasyon modelinin en önemli uyarı, insan AKI sızmak fizyolojik şartlar kısmi yönlerini özetlemek olabilir. Ani fiziksel hasar ile indüklenen hücre ölümünü farklı hücrelerde nekroz yol açan olayların çağlayan, ve bu farklı mikroçevrelerde gibi humoral faktörler aynı olmayabilir gibi. Ayrıca, böbrek hasarı sırasında apopitozu kanıt var ve bu sonuçları bir lazer ile aşağıdaki hakaret sızmak olmadığını bilinmemektedir. Ancak, sadece hücre kültürü gibi bazı iyi cevaplar son derece kontrollü bir ortamda gerektiren sorular, lazer ablasyon AKI in vivo modelde son derece kontrollü olarak hizmet edeceği bir araçtır . Gibi anlayışlar, büyük olasılıkla diğer renal yaralanmalar hakkında soruşturma uygulanan ve büyük olasılıkla, insanlar daha iyi teşhis oluşturmak için kullanılan temel anlayışlar keşfi teşvik edecek zebrafish böbrek epitel ablasyon çalışmaları topladı.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Embriyo yemekleri </td><td> Şahin </td><td> 35-1005 </td></tr><tr><td> Diseksiyon forseps </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Enjeksiyon iğne </td><td> Sutter Intruments </td><td> BF100-50-10 </td></tr><tr><td> Ultrasaf agaroz </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 40 kilodalton (kD) Dextran&#39;ın-floresein </td><td> Invitrogen </td><td> D1845 </td></tr><tr><td> Plastik transferi pipetlemeyin </td><td> Samco Bilimsel Fisher </td><td> 204, 13-711-23 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Metilselüloz </td><td> Sigma </td><td> M0262 </td></tr><tr><td> Depresyon slayt </td><td> Balıkçı </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> 12-kuyu çanak </td><td> Corning </td><td> 3512 </td></tr></tbody></table>

laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration

Akut böbrek hasarı (AKI), böbrek fonksiyonunun bozulması, böbrek yetmezliği 1 doruğa saat veya gün bir süre içinde yüksek mortalite oranları ile karakterize edilir. AKI iskemi, ilaç toksisitesi veya obstrüktif yaralanma 1 de dahil olmak üzere bir dizi faktörlerin neden olabilir. Bu sonuçlar sıvı ve elektrolit homeostazı korumak için bir yetersizlik. AKI on yıllar boyunca gözlenen olsa da, etkili klinik tedaviler henüz geliştirilecek. İlgi çekici bir zaman, sadece rudimentally 1,2 karakterize edilmiştir gizemli bir fenomen üzerinde, AKI olan bazı hastalarda böbrek fonksiyonları iyileşir. AKI memeli modelleri kullanarak araştırmalar, iskemik ya da nephrotoxin-yaralanan böbrekler nefron tübüller 1,2, epitel hücre tipleri 3 uzman bölgelerde bir dizi (segment) yapılan böbrek fonksiyonel birimleri epitel hücre ölümü deneyim göstermiştir . Nefron içinde proksimal tübül hücrelerinde, epitelyal hücre ölümü en yüksek düzeydedir. Hücre yıkım dediferansiyonunu, yayılması ve tamamen 1,2 nefron yeniden epitel hücreleri, Çevre göç olduğunu göstermektedir kanıt yoktur. Ancak, yaralanan böbrekler yeniden yetenek insanlar arasında geniş bir varyasyon nedenleri bu olaylar modüle sinyaller arasında değişen renal epitelyal rejenerasyon mekanizmaları hakkında birçok cevapsız sorular var. Larva zebrafish pronephric böbrek 4,5 memeliler dahil olmak üzere yüksek omurgalıların korunmuş nefron oluşan olarak böbrek epitel rejenerasyonu incelemek için mükemmel bir model sağlar. Zebra balığı larvalarının nefron çünkü genç zebrafish 6 göreli şeffaflık floresans teknikleri ile görüntülendi. Böbrekler, hayvan içinde içselleştirilmiş karmaşık sistemlerin yapısal, çünkü bu nefron erişilemez memeli modellerin aksine görüntü hücre ve moleküler değişiklikler, gerçek zamanlı olarak eşsiz bir fırsat sunuyor. Son çalışmalar, aminoglikozid gentamisin AKI ve sonraki böbrek yetmezliği çalışması için toksik bir etken ajan olarak istihdam var: gentamisin ve diğer antibiyotiklere AKI insanlarda neden olduğu gösterilmiştir, ve araştırmacılar zebrafish 7 böbrek hasarı tetiklemek için bu aracı kullanmak için yöntemler formüle sahip , 8. Ancak, Zebra balığı larvaları aminoglikozid toksisitesi etkileri felaket ve öldürücü olan epitelyal rejenerasyon ve fonksiyonu, zaman içinde okuyan bir zorluk sunuyor. Bizim metodumuz zebrafish epitel yaralanma çalışma için yeni bir aracı olarak kullanılması hedeflenen hücre ablasyon sunar. Lazer ablasyon araştırmacılar, hücrelerin sınırlı bir nüfus hücre ölümüne neden yeteneği verir. Hücre Değişen alanları morfolojik konumu, fonksiyonu, hatta belirli bir hücre fenotipi ifade dayanan hedeflenmiş olabilir. Böylece, lazer ablasyon araştırmacıları, çalışma özgüllüğü artacak ve renal epitelyal rejenerasyon mekanizmalarının ışık tutacak yeni ve güçlü bir yaklaşım olabilir. Bu protokol, geniş ilgi bağlamlarda herhangi bir sayıda yaralanma ve rejenerasyon çalışması için zebrafish embriyo diğer organlarda hücre popülasyonlarının hedef uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration at JoVE.com

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Insanlarda akut böbrek hasarı (AKI), böbrek nefron oluşturan epitel hücrelerin zarar görmesine neden olduğu yaygın bir klinik sorundur ve AKI, yüksek ölüm oranları% 50-70 ile ilişkili<sup&gt; 1</sup&gt;. Bu fenomenin rehberlik mekanizmaları ve sınırlamalar yeterince anlaşılamamıştır rağmen epitel hücre yıkılmasının ardından, nefron, yenilemek için sınırlı bir yeteneği var. Bu video makalede, zebrafish embriyo böbrek böbrek nefron hücrelerinin hedeflenen lazer ablasyon, veya pronephros için bizim teknik açıklar. AKI nefrotoksisite-kaynaklı modelleri tamamlıyor ve böbrek nefron epitel rejenerasyonu ile ilişkili olan hücre ve moleküler değişiklikler yüksek çözünürlüklü bir anlayış kazanmak için yeni bir yöntem kullanılabilir.

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Kortikal nöron: Hücre Tabanlı Tedaviler Laboratuvar gelişmeler geçiş

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Bilgisayar oluşturuldu Hayvan Modeli Uyaranlar

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Murin Böbrek Nakli Prosedürü

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Zebra balığı Maksiller Bärbel Çalışma Yöntemleri

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...