Name: in vivo electroporation of developing mouse retina
Uploaded: 2011-06-24T15:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH R01EY020560-01 e por um WM Keck jovem estudioso no Prêmio de Pesquisa Médica. Os autores gostariam de agradecer a Joseph Bedont por sua ajuda durante a imagens dos preparativos da retina e injeções.

1. Preparação plasmídeo para eletroporação A concentração de DNA necessária para eletroporação é 5μg/μl. Isso normalmente requer os plasmídeos desejava ser amplificados em um Maxi-prep (Qiagen) ou método equivalente seguido de uma purificação e concentração do DNA com a quantidade de trabalho. Os passos seguintes descrevem a preparação de DNA com a quantidade de trabalho. <ol><li> Alíquota de 100 mg de DNA (de Maxi prep ou equivalente) e diluir o volume de 100 mL para...

<ol>
	<li>Neumann, E., Rosenheck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+changes+induced+by+electric+impulses+in+vesicular+membranes.">Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).</li><li>Turnbull, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Letter:+Letter:+An+alternate+explanation+for+the+permeability+changes+induced+by+electrical+impulses+in+vesicular+membranes.">Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).</li><li>Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+ion+flow+in+Escherichia+coli+B+and+electrical+sizing+of+bacterias.">Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias.</a> Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).</li><li>Kinosita, K., Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-induced+pore+formation+and+hemolysis+of+human+erythrocytes.">Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pias3-dependent+SUMOylation+directs+rod+photoreceptor+development.">Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development.</a> Neuron. 61, 234-246 (2009).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+hormone+receptor+ERRbeta+controls+rod+photoreceptor+survival.">The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).</li><li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Core+Paired-Type+and+POU+Homeodomain-Containing+Transcription+Factor+Program+Drives+Retinal+Bipolar+Cell+Gene+Expression.">A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression.</a> J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li></ol>

Eletroporação in vivo representa um método rápido e eficiente para a transformação de células da retina com plasmídeos de expressão de DNA. Este método permite que o pesquisador para realizar estudos de ganho de função por ectopicamente introdução de um gene de interesse sob o controle de um promotor ubiquitously expressas ou para realizar estudos de perda de função usando construções shRNA alvo genes de interesse. Além disso, cosmídeos múltiplas podem ser electroporated simultaneamente, pe...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Tampão saturada de fenol </td><td> Invitrogen </td><td> 15513-039 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> JT Baker </td><td> 9180-03 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Acetato de sódio </td><td> JT Baker </td><td> 3470-05 </td><td> 3 M de ações </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Fisher Biotech </td><td> BP123-10 </td><td> Estoque de 10% </td></tr><tr><td> Álcool isopropílico prep </td><td> Tyco Healthcare </td><td> 6918 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 30 guage agulha </td><td> Terumo Medical Corp </td><td> SG2-3013 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Exmire microsseringa </td><td> Ito Corporação </td><td> MS * E05 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Tweezertrode (eletrodo pinça) </td><td> BTX Instrumento, Genetronics Inc. </td><td> 522 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Electro Praça Porator (electroporator) </td><td> BTX Instrumento, Genetronics Inc. </td><td> ECM 830 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Composto outubro </td><td> Sakura Finetek EUA </td><td> 4583 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of developing mouse retina

A caracterização funcional de genes expressos durante o desenvolvimento da retina de mamíferos ainda é um desafio significativo. Gene targeting para gerar perda constitutivo ou condicional de nocautes função permanece custo e mão de obra intensiva, bem como demorado. Adicionando a estes desafios, retina expressa genes podem ter um papel essencial fora da retina levando a confunde involuntária ao usar uma abordagem nocaute. Além disso, a capacidade de ectopicamente expressar um gene em um ganho de experiência função pode ser extremamente valiosa quando se tenta identificar um papel na especificação célula destino e / ou diferenciação terminal. Nós apresentamos um método para a incorporação rápida e eficiente de plasmídeos de DNA na retina do rato neonatal por eletroporação. A aplicação de impulsos elétricos curtos resultados acima de um determinado campo de força em um aumento transitório da permeabilidade da membrana plasmática, facilitando a transferência de material através da membrana 1,2,3,4. Trabalho inovador demonstrou que eletroporação poderia ser utilizada como um método de transferência de genes em células de mamíferos, induzindo a formação de poros da membrana plasmática hidrofílica permitindo a passagem de DNA altamente carregada através da bicamada lipídica 5. Desenvolvimento técnico contínuo resultou na viabilidade da eletroporação como um método para transferência de genes in vivo nos tecidos dos camundongos múltiplos, incluindo a retina, o método pelo qual é aqui descrito 6, 7, 8, 9, 10. Solução de DNA é injetado no espaço sub-retiniano assim que o DNA é colocado entre o epitélio pigmentado da retina e retina do mouse (P0) neonatal e pulsos elétricos são aplicadas usando um eletrodo de pinça. A colocação lateral dos olhos no mouse permite a fácil orientação do eletrodo de pinça para o alinhamento do pólo negativo necessário pole-DNA-retina-positivos. Incorporação extensiva e expressão de genes transferidos podem ser identificados por dia pós-natal 2 (P2). Devido à falta de migração lateral significativo de células da retina, regiões electroporated e não electroporated são gerados. Não electroporated regiões podem servir como controles internos histológico se for o caso. Eletroporação da retina pode ser usado para expressar um gene sob um promotor onipresente, como o CAG, ou para perturbar a função do gene usando construções shRNA ou Cre-recombinase. Expressão mais específica pode ser conseguida através da concepção de construções com os promotores de célula específica do gene. Visualização de células electroporated é conseguido usando construções bicistronic expressando GFP ou por co-electroporating uma expressão de GFP construir. Além disso, constrói múltiplas podem ser electroporated para o estudo dos efeitos do gene combinatorial ou ganho simultânea e perda de função de genes diferentes. Eletroporação da retina também podem ser utilizados para a análise genômica de cis-regulatórias elementos, gerando construções de expressão apropriada e mutantes exclusão. Tais experiências podem ser usados ​​para identificar regiões cis-regulatórias suficiente ou necessária para a expressão gênica de células específicas 11. Experiências potenciais são limitados apenas pela disponibilidade de construir.

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Um método para a incorporação de DNA plasmidial em células da retina de camundongos com o propósito de realizar qualquer ganho ou perda de função de estudos<em&gt; In vivo</em&gt; É apresentado. Este método capitaliza sobre o aumento transitório da permeabilidade da membrana plasmática celular induzida pela aplicação de um campo elétrico externo.

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por<em&gt; In Vivo</em&gt; Eletroporação

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

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Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Eletroporação pós-natal e tempo-lapso de neuroblasto Migração na aguda fatias do cérebro do rato

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...