Name: bromodeoxyuridine (brdu) labeling and subsequent fluorescence activated cell sorting for culture-independent identification of dissolved organic carbon-degrading bacterioplankton
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degradin

Financiering van dit project werd verzorgd door de National Science Foundation verleent OCE1029607 (tot XM) en MCB0702125 (tot MAM) en de Gordon en Betty Moore Foundation (tot MAM).

1. Watermonster verwerking <ol><li> Filter 10L milieu water door middel van een urn-poriegrootte membraanfilters tot grote deeltjes en bacteriovores te verwijderen. Verzamel het water filtraat in een mandfles. </li><li> Transfer 36 ml filtraat elk in drie steriele Eppendorf buisjes (50 ml) met 4 ml vers bereide paraformaldehyde-oplossing (PFA, 10%). Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur aan cellen te behouden. Verzamel cellen op 0,22-um-poriegrootte wit membraanfilters door vacuüm filtratie. Was het filter door het pas...

<ol>
	<li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton.">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li><li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria.">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li><li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater.">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li><li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities.">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li><li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+(BrdU)+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+(Exo+III)+digestion.">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li><li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR.">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li><li>Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+stains:+ribosomal+RNA-based+probes+for+the+identification+of+single+cells.">Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.</a> Science. 243, 1360-1360 (1989).</li><li>Artursson, V., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bromodeoxyuridine+immunocapture+to+identify+active+bacteria+associated+with+arbuscular+mycorrhizal+hyphae.">Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).</li><li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean.">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li><li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations.">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li><li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification.">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li></ol>

Onze aanpak koppels BrdU incorporatie, FACS en 16S rDNA analyse soort-niveau identificatie van bacterioplankton dat de afzonderlijke DOC componenten metaboliseren in het aquatisch milieu mogelijk te maken. De BrdU incorporatie assay labels bacteriële cellen op basis van metabolische activiteiten, die analyse maakt het mogelijk alleen op actieve bacteriën en dus bevat geen slapende cellen. In onze aanpak, BrdU incorporatie is in situ immunodetected en bacteriën die verschillende niveaus van BrdU incorporatie ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> BrdU </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> B5002-5G </td><td></td></tr><tr><td> Lysozym </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> L6876-5G </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> P2308-25mg </td><td></td></tr><tr><td> In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS </td><td> Uitrusting </td><td> Roche </td><td> 11810740001 </td><td> Verbruiken meer van anti-BrdU-FLUOS en Incubatiecentrum buffer per reactie dan wordt gesuggereerd door de fabrikant. </td></tr><tr><td> Frame-Seal Incubatie Chambers </td><td> Materiaal </td><td> Bio-Rad </td><td> SLF-1201 </td><td></td></tr><tr><td> Membraanfilters van polycarbonaat (142 mm diameter, 1,0 um-porie-formaat) </td><td> Materiaal </td><td> Millipore </td><td> FALP14250 </td><td></td></tr><tr><td> Membraanfilters van polycarbonaat (25-mm-diameter van 0,2 micrometer-porie-formaat) </td><td> Materiaal </td><td> Millipore </td><td> FGLP02500 </td><td></td></tr><tr><td> illustratie PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads </td><td> Uitrusting </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-9559-01 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick gelextractiekit </td><td> Uitrusting </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> FailSafe PCR-systeem </td><td> Uitrusting </td><td> EPICENTRUM </td><td> FS99060 </td><td></td></tr></tbody></table>

bromodeoxyuridine (brdu) labeling and subsequent fluorescence activated cell sorting for culture-independent identification of dissolved organic carbon-degrading bacterioplankton

Microben zijn belangrijke agenten bemiddelen de afbraak van een groot aantal opgeloste organische koolstof (DOC) substraten in het aquatisch milieu. Echter, de identificatie van bacteriële taxa die specifieke zwembaden van DOC te transformeren in de natuur vormt een technische uitdaging. Hier beschrijven we een aanpak die paren broomdeoxyuridine (BrdU) incorporatie, fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS), en 16S rRNA-gen op basis van moleculaire analyse van de cultuur-onafhankelijke identificatie van bacterioplankton in staat vernederende een specifieke DOC compound in het aquatisch milieu mogelijk maakt. Drievoud bacterioplankton microkosmossen zijn ingesteld om zowel BrdU en een model DOC verbinding (DOC amendementen), of alleen BrdU (no-toevoeging controle) te ontvangen. BrdU vervangt de posities van thymidine in nieuw gesynthetiseerde bacteriële DNA en BrdU-gelabeld DNA kan gemakkelijk immunodetected 1,2 te zijn. Door middel van een 24-uurs incubatie bacterioplankton die in staat zijn om gebruik maken van de toegevoegde DOC compound wordt verwacht dat ze selectief worden geactiveerd, en dus hogere niveaus van BrdU incorporatie (HI cellen) dan niet-ontvankelijk cellen in de DOC wijzigingen en cellen in no- Naast controles (lage BrdU incorporatie cellen, LI-cellen). Na de fluorescentie immunodetectie, zijn HI cellen onderscheiden en fysiek gescheiden van de LI cellen door fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) 3. Gesorteerd DOC-responsieve cellen (HI-cellen) zijn gewonnen voor DNA en taxonomisch geïdentificeerd door middel van de volgende 16S rRNA gen-gebaseerde analyses waaronder PCR, klonen bibliotheek bouw en sequencing.

Watch this Scientific Journal Video about Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degradin

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Milieu-bacterioplankton worden geïncubeerd met een model opgeloste organische koolstof (DOC) verbinding en een DNA-etikettering reagens, broomdeoxyuridine (BrdU). Daarna zijn DOC-afbrekende cellen gescheiden van de bulk-gemeenschap op basis van hun verhoogde BrdU incorporatie met behulp van fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS). Deze cellen worden vervolgens geïdentificeerd door de volgende moleculaire analyses.

Broomdeoxyuridine (BrdU) etikettering en Latere Fluorescentie Activated Cell Sorting voor cultuur-onafhankelijke Identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Generation of Human CD40-activated B cells

Generatie van de Mens CD40-geactiveerde B-cellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Sorteren van<em&gt; Streptomyces</em&gt; Cel Pellets behulp van een complex object Parametric Analyzer en Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold Labeling van de Gist endosomale systeem voor Ultrastructurele Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...