Name: bromodeoxyuridine (brdu) labeling and subsequent fluorescence activated cell sorting for culture-independent identification of dissolved organic carbon-degrading bacterioplankton
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degradin

Financiamento deste projeto foi fornecido pelo National Science Foundation concede OCE1029607 (para XM) e MCB0702125 (para MAM) eo Gordon e Betty Moore Foundation (a MAM).

1. Processamento de amostra de água <ol><li> Filtro de água 10L ambiental através de uma filtros mM de poros de tamanho de membrana para remover partículas grandes e bacteriovores. Recolher o filtrado em um garrafão de água. </li><li> Transferência de 36 ml cada filtrado em 3 tubos estéreis Eppendorf (50 ml) contendo 4 ml de solução recém-preparada de paraformaldeído (PFA; 10%). Incubar por 2 horas em temperatura ambiente para preservar as células. Coletar células para 0,22 mícrons de tamanho de poros f...

<ol>
	<li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton.">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li><li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria.">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li><li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater.">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li><li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities.">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li><li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+(BrdU)+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+(Exo+III)+digestion.">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li><li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR.">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li><li>Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+stains:+ribosomal+RNA-based+probes+for+the+identification+of+single+cells.">Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.</a> Science. 243, 1360-1360 (1989).</li><li>Artursson, V., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bromodeoxyuridine+immunocapture+to+identify+active+bacteria+associated+with+arbuscular+mycorrhizal+hyphae.">Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).</li><li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean.">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li><li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations.">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li><li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification.">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li></ol>

Casais a nossa abordagem incorporação de BrdU, FACS e 16S rDNA para permitir a análise em nível de espécie de identificação do bacterioplâncton que metabolizam os componentes individuais DOC em ambientes aquáticos. O ensaio de incorporação BrdU rótulos células bacterianas com base em atividades metabólicas, que permite a análise somente em bactérias ativas e, portanto, não inclui as células adormecidas. Em nossa abordagem, a incorporação é BrdU em bactérias in situ immunodetected ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> BrdU </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> B5002-5G </td><td></td></tr><tr><td> Lisozima </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> L6876-5G </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> P2308-25mg </td><td></td></tr><tr><td> In Situ Proliferação Celular Kit, FLUOS </td><td> Conjunto </td><td> Roche </td><td> 11810740001 </td><td> Consumir mais de Anti-BrdU-FLUOS e tampão de incubação por reação do que o sugerido pelo fabricante. </td></tr><tr><td> Quadro Seal-Chambers Incubação </td><td> Material </td><td> Bio-Rad </td><td> SLF-1201 </td><td></td></tr><tr><td> Filtros de membrana de policarbonato (142 mm de diâmetro, 1,0 mM de poros de tamanho) </td><td> Material </td><td> Millipore </td><td> FALP14250 </td><td></td></tr><tr><td> Filtros de membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro, 0,2 m de poros de tamanho) </td><td> Material </td><td> Millipore </td><td> FGLP02500 </td><td></td></tr><tr><td> illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads </td><td> Conjunto </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-9559-01 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick extração de gel kit </td><td> Conjunto </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> FailSafe PCR System </td><td> Conjunto </td><td> Epicentro </td><td> FS99060 </td><td></td></tr></tbody></table>

bromodeoxyuridine (brdu) labeling and subsequent fluorescence activated cell sorting for culture-independent identification of dissolved organic carbon-degrading bacterioplankton

Micróbios são agentes importantes mediando a degradação do carbono dissolvido numerosos orgânico (DOC) substratos em ambientes aquáticos. No entanto, a identificação da taxa de bactérias que transformam a grupos específicos de DOC na natureza representa um desafio técnico. Aqui nós descrevemos uma abordagem que os casais bromodeoxiuridina incorporação (BrdU), separação de células ativadas por fluorescência (FACS), e 16S rRNA gene baseada em análise molecular que permite que a cultura independente de identificação do bacterioplâncton capazes de degradar compostos DOC uma específicos em ambientes aquáticos. Microcosmos bacterioplâncton triplicado são configurados para receber tanto BrdU e um composto modelo DOC (DOC alterações), ou apenas BrdU (sem adição de controle). Substitutos BrdU as posições de timidina no DNA recentemente sintetizado bacteriana e BrdU marcado DNA pode ser prontamente 1,2 immunodetected. Através de uma de 24 horas de incubação bacterioplâncton, que são capazes de usar o composto adicionado DOC são esperados para ser seletivamente ativado, e, portanto, têm níveis mais elevados de incorporação de BrdU (células HI) que os não-responsivos células nas alterações DOC e células em no- Além controles (células de baixa incorporação de BrdU, células LI). Depois de imunodetecção de fluorescência, as células HI são distinguidos e separados fisicamente das células LI por separação de células ativadas por fluorescência (FACS) 3. Ordenado DOC-responsiva (células HI) são extraídos de DNA e identificados taxonomicamente por meio de 16S rRNA gene subseqüentes análises baseadas incluindo PCR, clonagem e sequenciamento de construção da biblioteca.

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Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bacterioplâncton ambientais são incubados com um modelo de carbono orgânico dissolvido composto (DOC) e um reagente rotulagem DNA, bromodeoxiuridina (BrdU). Depois, DOC-degradante células são separadas da comunidade em massa com base em sua incorporação BrdU elevada usando separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Estas células são então identificadas por análises subseqüentes molecular.

Bromodeoxiuridina Labeling (BrdU) e separação de células subseqüentes Fluorescence Activated de Cultura independente de Identificação de carbono orgânico dissolvido de degradação bacterioplâncton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Generation of Human CD40-activated B cells

Geração de humanos CD40-activated células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Biologia

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

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Classificando de<em&gt; Streptomyces</em&gt; pellets de células usando um objeto complexo Parametric Analyzer e Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold Labeling do Sistema de levedura Endossomal de Análises ultraestruturais

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com Metiltransferases e cofator Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...